CA Patent 2550301 - TISSUE REGENERATION METHOD

Description

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"Verfahren zur Regeneration von Gewebe" Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Induktion des strukturellen Wachstums von Gewebe, insbesondere bei der Leberregeneration und nimmt die Priorit�ten der deutschen Patentanmeldung 103 61 813.9-41 und der europ�ischen Patentanmeldung 03 029 961.4 in Anspruch, auf die inhaltlich Bezug genommen wird.

In der Ontogenese werden Wachstumsfaktoren exprimiert, die grundlegende strukturelle und hinsichtlich der Zellzahl numerische Prozesse f�r den Aufbau eines Gewebes ausl�sen k�nnen. Im wachsenden und im adulten Organismus geht die F�higkeit, strukturell und funktionell intakte Gewebe aufzubauen oderim Falle von Gewebesch�digungen-zu regenerieren, allerdings weitgehend verloren. Es wird vermutet, dass die verminderte Expression von Wachstumsfaktoren, die ihrerseits die Expression von f�r den Gewebeaufbauerforderli- chen Proteinen kontrollieren, f�r diese Reduktion an Regenerationsf�higkeit verantwortlich ist.

Es ist jedoch zumindest von einige Organen bekannt, dass sie selbst im adulten Organismus eine F�higkeit zur Selbst-Regeneration behalten, die durch Verletzungsprozesse induziert werden kann. So ist beispielsweise die Regenerationskapazit�t der Leber bereits seit der Antike bekannt. Fast alle anderen Organe k�nnen strukturelle Defekte nicht von sich aus entsprechend �berbr�cken um, das originale Gewebe wiederherzustellen.

Die Leber befindet sich im adulten Organismus in der Regel im ruhenden, das heisst nicht-proliferierenden Zustand, in dem das Organ eine komplexe Vielfalt

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verschiedenermetabolischer Funktionen erf�llen muss. In vivo wird die Leber allerdings durch den Verlust vonZellmasse-z. B. durch eine Leberzellsch�digung oder durch einen chirurgischen Eingriff-erneut zum Wachstum angeregt.

Proliferierendes

Lebergewebe ersetzt die funktionellen und anatomischen Strukturen des Organs meist jedoch nicht in der gew�nschten Weise, sondern f�hrt in der Regel zu einer Vergr�sserung und Hypertrophie des verbliebenen Lebergewebes, bis die urspr�ngliche Leberzellmasse ersetzt ist. Die Intensit�t der Wachstumsantwort ist von dem Ausmass des Gewebeverlustes abh�ngig.

Der zeitliche Verlauf der Leberregeneration korreliert dabei umgekehrt proportional, das heisst kleine Leberzellverluste werden langsam ersetzt, grosse Leberzellverluste wesentlich rascher.

Der Ersatz der Organmasse durchZellproliferation allein stellt daher keine ausreichende Basis f�r die Therapie eines Patienten mit erheblichem Organschaden dar. Es sind daher verschiedene Ans�tze f�r die Induktion strukturellen Wachstums-d. h. f�r ein formschaffendes Wachstum-von Geweben bekannt, die jedoch allesamt noch nicht zu einem befriedigenden Erfolg gef�hrt haben. Ein solchesstrukturelles Wachstum von Zellen w�re jedoch gerade f�r therapeutische oder biotechnologische Verfahren von erheblicher Bedeutung.

In der Vergangenheit wurde versucht, Wachstum von Zellen �ber die Gabe von Wachstumsfaktoren, wie z. B."Epidermal Growth Facto" (EGF),"Vascular Endothelial Growth Factor" (VEGF) oder"Hepatocyte Growth Factor" (HGF) zu induzieren. Die Wirkung dieser Faktoren auf die Vermehrung prim�rer Zellen in vitro ist jedoch begrenzt. Ihr Einsatz in vivo ist dagegen aufgrund ihrer m�glichen Nebenwirkungen-z. B. der Aktivierung von Onkogenen-nicht unproblematisch.

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Ein anderer Ansatz basiert auf der Verwendung komplexer heterologer Gewebeextrakte, z. B. aus der Hypophyse oder dem Hypothalamus, zur Induktion der Zellvermehrung beispielsweise von kultivierten Hepatozyten (siehe z. B. US 6,008, 047). Die Verwendung tierischer oder humaner Gewebeextrakte ist jedoch vor dem Hintergrund �bertragbarer viraler Erkrankungen, wie z. B. BSE, Schweine-oder Schaf-Viren, im Laborbetrieb oder in der klinischen Anwendung problematisch und dokumentiert eher das mangelnde Wissen um die Prozesse, die an dem Aufbau komplexer Organstrukturen beteiligt sind sowie um die eigentlich relevanten Faktoren und deren Einsatz-und Wirkpotentiale. Zudem sind die Extrakte in ihrer Qualit�t schwer definierbar, da diese u. a. von der Quelle und deren Kultivierungsbedingungen abh�ngt.

Selbst die wenigen Erkenntnisse aus den klassischen Anwendungen der prim�ren Gewebekulturen lassen sich allerdings nicht unmittelbar auf die Fragestellungen des tissue engineering �bertragen. So geht das tissue engineering in der Regel idealerweise von patientenspezifischen, adultenZellsystemen aus, die bereits weiter differenziert sind als f�tale oder embryonale Zellen. Ausserdem handelt es sich bei dem tissue engineering sowohl in situ als auch in vitro um Kokultursituationen, die in der klassischen Anwendung nicht ber�cksichtigt werden. Es wird dagegen viel eher sogar versucht,Kokulturen aus Endothelzellen, Makrophagen und Fibroblasten, wie sie in der Leber vorkommen, bei der Expansion der parenchymat�senLeberzellen zu vermeiden, da sie nicht erw�nscht sind.

Aus der WO 02/092013 A2 ist es bekannt, einem Patienten zur Behandlung von Lebersch�den eine therapeutisch effektive Menge von Wachstumshormon (Growth Hormone, GH) zu verabreichen, um damit das nat�rliche Regenerationsverm�gen der Leber zu f�rdern. Danach hat GH die Wirkung, die Expression des Wachstumsfaktors Fox M1B bei Hepatozyten zur beschleunigten und

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so das Leberwachstum erneut zu initiieren.

Das Wachstumshormon hat jedoch eine sehr breite und daher unspezifische Wirkung auf das Wachstum von Geweben. Daher werden durch GH-Gabe auch ungewollte Nebenwirkungen oder�berreaktionen z. B. in Form der sogenannten Akromegalie, d. h. einer �berschiessenden Verkn�cherung mit pathologischen Knochenzust�nden, erzeugt. Des weiteren wurde in der Zwischenzeit bekannt, dass Fox1M inBasalzellkarzinomen hochreguliert wird. Die Fox-Proteine spielen eine wichtige Rolle in der Regulation der Wachstumsgene bei der Vermehrung, Differenzierung und der Transformation, u. a. auch bei der Aktivierung von sogenannten SONIC HEDGEHOG (Shh) Signalwegen. Diese wiederum sindinvolviert in der Aktivierung vonBasalzellkarzinomen in menschlicher Haut. So konnten Teh et al. zeigen (Cancer Research 2002, August 15 ; 62 (16) : 4773- 80), dass die Hochregulierung von FoxM1 in Basalzellkarzinomen eine der wesentlichen Initiations-Mechanismen ist, wodurch die SONIC HEDGEHOG-Signalwege mitogene Effekte in denbasalenKerotinozyten aus�ben, wodurch es zu der Entwicklung des weit verbreiteten menschlichen Krebsgeschw�rs kommt. Dieses tumorigene Potential von Fox1 M Agonisten und die mangelnde Spezifit�t und ubiquit�re Pr�senz in allen Geweben steht daher der Verabreichung von GH zur F�rderung der Leberregeneration entgegen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren bereitzustellen, das die Induktion eines im wesentlichen strukturellen Wachstums eines Gewebes induziert. Dieses Wachstum sollte vorzugsweise zu einer im wesentlichen funktionellen und strukturellen Funktionsf�higkeit des betroffenen Gewebes f�hren.

Erfindungsgem�ss wird diese Aufgabe gel�st durch den Einsatz von h�matopoetischen Cytokinen, deren Derivate oder Analoga bzw. Teilen f�r die strukturelle

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und funktionelle Leberregeneration. In einer besonders bevorzugten Ausf�hrungsform wird Erythropoietin (EPO) oder ein Derivat, Teilen oder Analogon davon verabreicht. Der erfindungsgem�sse Effekt auf das betroffene Gewebe kann jedoch auch durch die Applikation von Thrombopoietin oder Teilen davon erreicht werden.

Es hat sich �berraschenderweise gezeigt, dass durch die Applikation von h�matopoietischen Wachstumsfaktoren wie EPO und TPO nicht nur eine Vermehrung der Zellen, sondern auch ein strukturelles Wachstum einsetzt. Dieses Wachstum setzt insbesondere an zuvor traumatisierten Geweben ein. Das dadurch induzierte Wachstum f�hrt in vivo zu einer Gewebe-Regeneration im eigentlichen Sinne, d. h. es findet nicht nurproliferatives Wachstum, sondern gerichtetes, differenziertes Wachstum zum Aufbau komplexer Strukturen statt.

Im Kern basiert die erfindungsgem�sse Verwendung der h�matopoietischen Faktoren f�r die Geweberegeneration im wesentlichen auf zwei bisher nicht bekannten Wirkungen des EPO, n�mlich einerseits auf der Stimulation des strukturellen Wachstums in synchroner und koordinierter Form von verschiedener Zelltypen untereinander und miteinander (wie z. B. Fibroblasten, glatten Muskelzellen mitEndothelzellen im Gef�ssbereich in Verbindung mit einer Neubildung der Architektur eines kompletten Gef�sses unter Ber�cksichtigung derextrazellul�ren Matrix (Kollagen, Elastin, Fibronektin,Entaktin)) und einer Komplettierung des eigentlichen parenchymat�sen Gewebeverbandes. Dies beinhaltet z. B. die Ausbildung von Hepatozyten mit den verbundenen Kupffer Zellen, Pit-Ito-und Endothelzellen (sog. nichtparenchymale Zellen der Leber).

Neben der Ausbildung eines tats�chlichen Gef�ssbaumes und dessen Interkonnektion wird somit erfindungsgem�ss eine Geweberegeneration im Sinne der restitutio ad integrum induziert.

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In der Leber f�hrt dies zu einer Mischung aus sinusoidalen Kapillaren im End-strombereich und vaskul�ren zu-und abf�hrenden Gef�ssen neben dem eigentlichen Parenchymverband der Hepatozyten in einer geordneten 3-D. Struktur.

Wie bereits ausgef�hrt, setzt die erfindungsgem�sse Wirkung der h�matopoietischen Wachstumsfaktoren insbesondere bei traumatisierten Geweben und Zellen ein. Dabei wird der Begriff des Traumas als Gegensatz zu dem Prozess der Histogenese(Gewebebildung) definiert. Es handelt sich demnach bei einem Trauma um einen Prozess, der der Histogenese als Gewebildungsprozess im Individualorgismus an den betreffendenLokalisationen entgegenwirkt bzw. das Ergebnis der Histogenese zunichte macht. Das Trauma als Gewebesch�digung kann durch eine Vielzahl von Ereignissen ausgel�st werden, z. B. durch Verletzungen, Entz�ndungen oder durch Autoimmunerkrankungen mit Selbstbesch�digung). Diese Gewebesch�digungen oder-zerst�rungen l�sen wiederum eine Vielzahl von Reaktionen aus, so z. B. die Aktivierung von Makrophagen, Mastzellen und immunkompetenten Zellen, die chemotaktische, vasoaktive und wundheilungsf�rdernde Faktoren sezernieren, und dadurch systemische und regioselektive Mechanismen regulieren.

Die Vorteile der erfindungsgem�ssen Verwendung der h�matopoietischen Wachstumsfaktoren, insbesondere des EPO, erstrecken sich auf die Regeneration von Geweben aller vier Grundgewebearten, n�mlich des Bindegewebes, des Muskelgewebes, desEpithelgewebes und des Nervengewebes. Diese Gewebe leiten sich ontogenetisch entweder aus dem Mesoderm (Bindegewebe, Muskel, Endothel (als besondere Form des Epithels)), dem Endoderm (das den Gastrointestinaltrakt auskleidende Epithel) oder dem Ektoderm (Nervengewebe) ab. In der Vergangenheit wurde gezeigt, dass der EPO-Rezeptor sowohl auf Zellen meso-als auchendodermalen Ursprungs sowie auf neuronalen Zellenexprimiert wird.

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In diesen Geweben f�hrt die erfindungsgem�sse Verwendung von EPO oder TPO zu einem ortsst�ndigen Recruitment der gewebespezifischen Progenito-renpopulation (Stammzellen), der Migration der Zellen und der Differenzierung bzw. Transdifferenzierung der Zellen in Parenchym-undStrukturzellen. W�hrend und vor dieser Gewebsbildung vermehren sich die Zellen durch die EPO Gabe.

Bei der Anwendung des erfindungsgem�ssen Verfahrens beispielsweise f�r die Leberregeneration kann eine erneute Vervollst�ndigung des zuvor gesch�digten Organs zu einem kompletten parenchymat�sen Gewebeverband erreicht werden, einschliesslich der Ausbildung von Hepatozyten mit Kupffer-Zellen, Pit-, Ito-und Endothelzellen. Mit der weiterf�hrenden Ausbildung eines Gef�ssbaums ist somit erfindungsgem�ss die Geweberegeneration als restitutio ad integrum m�glich.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgem�ssen Verfahrens liegt somit darin, dass nicht nur die Mikokapillarisation des regenerierenden Gewebes �ber eineEndothelaussprossung stimuliert wird, sondern auch die Parenchymregeneration und die Ausbildung der Wandstrukturen gef�rdert werden. Erst dies f�hrt zu dem gew�nschten Ergebnis des koordinierten dreidimensionalen Wachstums zum Aufbau eines funktionsf�higen Organs.

Somit basiert die erfindungsgem�sse Verwendung auf einer EPO-Wirkung, die weit �ber die bisher bekannte EPO-Wirkung als angiogentischer Faktor auf dieEndotheizellenvermehrung hinausgeht (Journal of Nephrology 2002 15,97 bis 103). Da mikrovaskul�re Strukturen wie Kapillaren und Sinusoide lediglich aus Endothelzellenauskleidung bestehen und keine eigene Wandstruktur aufweisen, konnte ausgehend von derangiogenetischen Wirkung des EPO bisher

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jedoch lediglich dar�ber spekuliert werden, ob EPO auch bei der Gef�ssneubildung und Wundheilung eine gewisse Bedeutung zukommen k�nnte (Journal of Nephrology 2002 15,97 bis 103). Eine Substantiierung dieser Spekulationen blieb bislang aber aus.

Daher ist es vorliegend um so bedeutender, dass erstmals der Nachweis der Wirkung des EPO auf das synchronisierte und koordinierte Wachstum der Gef�sse selbst, d. h. einschliesslich der Ausbildung der Wandstrukturen und die Parenchymregeneration gelungen ist.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgem�ssen Verfahrens besteht darin, dass das strukturelle Wachstum nicht notwendigerweise eine vorgegebene organische oder anorganische dreidimensionale Struktur als Ausgangspunkt ben�tigt, sondern viel eher eine Organ (teil) struktur de novo schafft. Somit kann die Applikation der h�matopoietischen Wachstumsfaktoren eine deutlich beschleunigte Selbst-Regeneration eines besch�digten Gewebes induzieren, was in der klinisch-therapeutischen Anwendung der Erfindung von grosser Bedeutung ist.

In einer besonders vorteilhaften Ausf�hrungsform der Erfindung werden die h�matopoietischen Wachstumsfaktoren eingesetzt, um die Regeneration eines Gewebes zu induzieren, das traumatisch gesch�digte Bereiche aufweist. In diesen Gewebeabschnitten kann damit nicht nur ein Verschluss der Wunde durch die Ausbildung einesGranulationsgewebes mit einsetzender Angiogenese angeregt, sondern die Neubildung der gewebespezifischen dreidimensionalen Struktur ausextrazellul�rer Matrix z. B. aus Kollagen, Elastin, Fibronektin oder Etnaktin.

Erfindungsgem�ss werden h�matopoietische Wachstumsfaktoren eingesetzt. Dabei handelt es sich vor allem um Thrombopoietin, Erythropoietin und das

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Wachstumshormon (GH) sowie deren funktionell und strukturell homologe Analoga, Derivateund/oder Teilen davon. Insbesondere aber werden EPO oder TPO bzw. deren Teile, Derivate oder Analoga eingesetzt. Es eignen sich auch deren mimetische Peptide (siehe unten). Zu den h�matopoetischen Wachstumsfaktoren z�hlen weiterhin G-CSF und GM-CSF.

Bei den h�matopoietischen Wachstumsfaktoren handelt es sich um linksseitige Vierfachhelixb�ndelproteine mit einer Orientierung rauf-rauf--runter-runter mit zwei �berreichenden Schleifen, die die ersten beiden und die letzten beiden Helixstrukturen miteinander verbinden (LivnahO. etal., Science 1999,283 (5404) : 987-90 und Ultsch M. H. et al, Blood 1995,86 (2) : 540-7. Die jeweiligen RBD Domainen (rezeptorbindenden Dom�nen) besitzten eine ausgepr�gte Homologie mit EPO. Thrombopoietin, Erythropoietin und Wachstumshormon binden an den MPL-Rezeptorkomplex. In der Publikation vonYoussoufianh et al. in Blood 1993,819 2223 bis 36, Structure function and activation of the Erythropoietin receptor) wird eine produktive Dimerisation beschrieben.

Erythropoietin und Thrombopoietin, mimetische Peptide (EMP und DMP) und weiterhin nicht-peptidische kleine Molek�le sind ebenso funktionell, wenn auch auf einer niedrigeren molaren Basis (Publikationen : Wrighton NC et al. Small peptides as mimetics of the protein hormone erythropoietin Science 1996,273 (5274) 458-64 und Cwirla S. E. et al. Peptide agonist of the thrombopoeitin receptor as potent as the natural cytokine, Science 1997,27653191696-9 und Qureshi S. A. et al. Mimicry of Erythropoietin by non peptid molecules, Proceedings National Academy of Sciences PNAS USA 1999, (9621) : 12156-61).

Die Bindung von EMP 1 an den Rezeptor geschieht an Bindungsstellen, die homolog zu den Hotspots der Wachstumshormonrezeptorverbindungen sind.

Die Struktursequenzen von Thrombopoietin sind im Detail in EP1 201 246 A2 beschrieben. Die Struktursequenzen von Erythropoietin sind im Detail in der europ�ischen Patentanmeldung EP 84 308 654.7 beschrieben.

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In einer besonders vorteilhaften Ausf�hrungsform der Erfindung wird EPO verwendet, das in vivo die Bildung von Erythrozyten sowie die Zellteilung und Differenzierung vonErythrozyten-Vorl�uferzellen stimuliert. EPO ist entweder aus Urin isolierbar oder aber rekombinant herstellbar. Die Herstellung eines rekombinanten humanen EPO ist Gegenstand der WO 86/03520. Des weiteren ist EPO Gegenstand der EP 0 148 605, EP 0 205 564, EP 0 209 539, EP 0 267 678 oder EP 0 411 678.

Es k�nnen jedoch auch Derivate des nativen oder rekombinanten EPO eingesetzt werden. So ist beispielsweise ein EPO-Derivat bekannt (EP 0 640 619B1), das zus�tzliche Glykosylierungsstellen und somit einen h�heren Kohlenhydratanteil mit 22 Sials�ureresten aufweist. Der Vorteil dieser Modifikation besteht darin, dass mit einem erh�hten Anteil an Sisals�ure die Halbwertzeit des EPO im Plasma zunimmt, da nur ein nicht-sialisiertes EPO an dem am EPOAbbau beteiligten Galactose-Rezeptor der Leber binden kann. DiesesEPO-De- rivat-bekannt unter der Abk�rzung NESP (Novel Erythropoiesis Stimulating Protein oder Darbepoetin) -weist zwar im Vergleich zum rekombinanten EPO eine an f�nf Positionen ver�nderte Aminos�uresequenz auf. Es entspricht aber in seiner Wirkung auf die Stimulation der Erythrozytenbildung im wesentlichen dem nativen oder rekombinanten EPO (Fisher, J. W. : Erythropoietin : Physiology and Pharmacology Update. Erythropoietin 2003,1-14). Die EP 0 640 619B1 wird hinsichtlich der Struktur und Herstellung des NESP vollumf�nglich in Bezug genommen.

Das NESP kann zur weiteren Verl�ngerung der in vivo Halbwertzeit vorteilhafterweise noch mit Polyethylenglykol (PEG) chemisch konjugiert werden, ohne dass damit eine Ver�nderung der biologischen Aktivit�t verbunden w�re. Ein derart modifiziertes NESP ist aus der WO 01/76640 bekannt, die hinsichtlich

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der Struktur und Bereitstellung dieses EPO-Derivats vollumf�nglich in Bezug genommen wird.

Aus der WO 02/49673 A2 und WO 01/02017 A2 sind ebenso pegylierte Derivate des EPO bekannt, die neben der verl�ngerten Plasma-Halbwertzeit auch eine h�here klinische Wirksamkeit zeigen. Dazu werden beispielsweise durch gezielte Mutagenese 1 bis 6 zus�tzliche Glykosylierungsstellen in die EPOAminos�uresequenz eingebracht. Auch dieses Derivat kann erfindungsgem�ss eingesetzt werden.

Neben EPO und EPO-Derivaten mit entsprechender biologischer Funktion k�nnen auch andere h�matopoietische Wachstumsfaktoren wie beispielsweise TPO oder Teile davon erfindungsgem�ss eingesetzt werden.

Bei dem TPO (bekannt auch als c-Mpl-Ligand, mpl-Ligand, Megapoietin oder Megakariozyten-Wachstums-und Entwicklungsfaktor) handelt es um einen h�matopoietischen Wachstumsfaktor mit einer komplexen biologischen Wirkung, der unter anderem die Entwicklung und Proliferation von Megakariozyten und Thrombozyten reguliert. Das reife TPO besteht aus einer Sequenz aus 332 Aminos�uren, wobei die N-terminale Region (RBD-Dom�ne) mit 154 Aminos�uren eine erhebliche Sequenz-und Strukturhomologie zu EPO aufweist (20 % Identit�t und weitere 25 % �hnlichkeit). Insbesondere bildet das TPO zwei hoch konservierte Cysteinbr�cken aus, die an homologen Positionen auch im EPO zu finden sind.

Es wurde in der Vergangenheit gezeigt, dass die N-terminale Region des TPO f�r die Bindung an den Cytokin-Rezeptor und die damit induzierte Signalaskade �ber den JAK/STAT Weg verantwortlich ist (Geddis A. E., Linden H. M., Kaushansky K : Thrombopoietin : a pan-hematopoietic cytokine. Cytokine &

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Growth Factor Reviews 13 (2002) 61-73). Erfindungsgem�ss kann daher auch nur ein Teil des TPO, insbesondere das N-terminale Fragment, verwendet werden.

Die Herstellung und Charakterisierung von TPO und dessen Varianten sind beispielsweise in EP 1 201 246,W095/21919,W095/21920 und W095/26746 beschrieben. Diese werden zu Offenbarungszwecken vollumf�nglich in Bezug genommen. Die Wirkung von TPO auf f�tale Hepatozyten ist aus Untersuchungen von E. Schmelzer bekannt (E. Schmelzer : Optimierung der Kultur und Charakterisierung prim�rer embryonaler Hepatozyten der Ratte ; Dissertation G�ttingen 2002).

Als Varianten von TPO eignen sich beispielsweise die in derW095/21919 beschriebenen TPO-Derivate oder die inW095/21920 beschriebenen allelischen Varianten oder Spezieshomologe oder das in W095/26746 und EP 1 201 246 beschriebene pegylierte TPO, ohne sie darauf zu beschr�nken. Als pegyliertes TPO wird im Sinne der vorliegenden Erfindung TPO-Derivate verstanden, die an ein organisches Polymer, wie z. B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylen, gebunden sind. Als weitere Varianten von TPO werden auch Derivate von TPO verstanden, die eine Sequenzidentit�t von weniger als 100% besitzen und dennoch die Aktivit�t von TPO, wie vorzugsweise in EP 1 201 246 beschrieben, besitzen. �blicherweise besitzen TPO-Derivate eine Sequenzidentit�t von mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, insbesondere mindestens 80% und vor allem mindestens85% im Vergleich zu humanem TPO einschliesslich derer Fragmente mit TPO-Aktivit�t. Eine besonders bevorzugte TPO-Aktivit�t im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die Beschleunigung der Proliferation, Differenzierung und/oder Reifung von Megakaryozyten oder Megakaryozyten-Vorl�ufer in Pl�ttchen-produzierende Formen dieser Zellen durch TPO oder dessen Varianten.

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Erfindungsgem�ss k�nnen EPO und TPO sowohl in ihrer humanen als auch in ihrer nicht-humanen Form eingesetzt werden. So zeigen beispielsweise humanes TPO mit Schweine-oder Maus-TPO eine Homologie von �ber 70%.

In einer alternativen Ausf�hrungsform der Erfindung ist es m�glich, dem Patienten nicht die h�matopoietischen Wachstumsfaktoren selber, sondern Faktoren zu verabreichen, die die Expression der Wachstumsfaktoren in den traumatisierten Geweben induzieren.

So ist beispielsweise von Naughton BA et al beschrieben (Age-related variations in hepatic regeneration and erythropoietin production in the rat, Am J Anat.

1977Ju1 ; 149 (3) : 431-8), dass Erythropoietin haupts�chlich in der Leber und Milz w�hrendneonataler Phasen gebildet wird und dass bei Nephrektromie das Ph�nomen der hepatischen EPO Bildung nach einer Hepatektomie wieder zunehmen kann. Diese F�higkeitnimrnt mit dem Alter ab. Sp�ter wurde dann erkannt (Hepatic regeneration and erythropoietin production in the rat. Naughton BA, KaplanSM, Roy M, Burdowski AJ, Gordon AS, Piliero SJ. Science. 1977 Apr15 ; 196 (4287) : 301-2. ), dass eine regenerierende Leber Erythropoietin als Antwort auf Hypoxie produziert. Es wurde gefunden, dass die EPO-Produktion abh�ngig ist vom Stadium der Leberregeneration, wobei die h�chsten EPO Konzentrationen in der Phase des st�rksten Leberwachstums gefunden wurden.

Dornfest etal. beschrieben 1981 (Recovery of an erythropoietin inducing factor from the regenerating rat liver. Dornfest BS, Naughton BA, Kolks GA, Liu P, Piliero SJ, Gordon AS. Ann Clin Lab Sci. 1981 Jan-Feb ;11 (1) : 37-46. ), dass die Leber die Hauptquelle f�r die Bildung eines EPO-induzierenden Faktors ist. Bei Nephrektomie nahm die Bildung des Faktors in der Leber zu. Somit kann die

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erfindungsgem�sse Wirkung des EPO auch mittelbar durch die Verabreichung eines Faktors erreicht werden, der die Expression des EPO induziert.

Ebenso kann die endogene EPO-Expression beispielsweise durch die Stimulierung der EPO Sekretion durch die mittel-oder langfristige Verabreichung des Wachstumshormons (Growth Hormone, GH) erreicht werden (Sohmiya, M., Y.

Kato. Effect of long-term administration of recombinant human growth hormone (rhGH) on the plasma erythropoietin (EPO) and haemoglobin levels in anaemic patients with adult GH deficieny. Clinical Endocrinology (2001) 55,749-754).

Die einzelnen Konzentrationen der Wachstumsfaktoren k�nnen in L�sung bei ca. 1 bis ca. 100ng/ml, vorzugsweise bei ca. 10 bis ca. 50ng/mi, insbesondere bei ca. 10 bis ca. 20ng/ml liegen. Bei lokalen Beschichtungen (topischser Verabreichung) k�nnen die Konzentrationen der Wachstumsfaktoren jedoch auch ein Vielfaches davon betragen.

Die h�matopoietischen Wachstumsfaktoren k�nnen vorteilhafterweise auch f�r die Kultivierung von Gewebekulturen in vitro eingesetzt werden. Dazu werden die Zellen in f�r das Gewebe besonders geeigneten Vorrichtungen und Verfahren kultiviert, beispielsweise auf einem Gitter mit einer schneidenden Maschenstruktur von 500 m Gr�sse, um immer wieder neue Tochteraggregate von Hepatozyten entstehen zu lassen. Insbesondere in vitro sind Kombinationen von EPO mit GH vorteilhaft.

Insbesondere k�nnen ber�hrungslose, automatisch oder manuell gesteuerte Pumpsysteme eingesetzt werden, die z. B. aus Kolbenpumpen bestehen oder magnetisch bzw. durchDruckluftkompression von Schl�uchen erzeugte, gerichtete Str�me erzeugen. In Anwesenheit vonEndothelzellen kann es durch den Scherstress in einem perfundierten Bioreaktor zu einer spontanenKon-

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fluenz der Endothelzellen auf den Oberfl�chen der Aggregate kommen, was f�r die weitere Verwendung vorteilhaft sein kann.

F�r die Einkapselung eignen sich dem Fachmann bekannte, geeignete Materialien, in die beispielsweise strukturierte Formen oder R�ume integriert werden, die eine in situ Wachstumsstruktur bzw. Vergr�sserung erm�glichen. Alternativ kann auf die Kapsel verzichtet werden und beispielsweise in Gegenwart vonEndothelzellen eine Endothelialisierung und somit eine optimale H�mokompatibilit�t erreicht werden.

Die erfindungsgem�sse Gabe von EPO oder TPO f�hrt entweder alleine oder bei gr�sserenstrutkurellen Defekte auch in Verbindung mit scaffold Materialien zu einem biologischen Gewebeersatz. Diese Tr�germaterialien k�nnen in vitro bzw. extrakorporal vorbesiedelt sein, biologisch modellierbar (biodegradabel) sein und sind mikro-undmakrostrukturell und biochemisch im Idealfall der zu ersetzenden Struktur m�glichst �hnlich. Die biochemische N�he bzw. Identit�t beinhaltet eine Rekonstruktion der in vivo Zusammensetzung durch Kollagene und Matrixproteine (Elastin, Fibronektin und alle Matrixkomponenten des K�rpers in gewebespezifischer Pr�gung wie bekannt).

Stammzellen

k�nnen aus den verschiedenen im K�rper des Patienten vorhandenen Quelle erhalten werden : Knochenmark, peripheres Blut, Fettgewebe, dem Gewebe

selbst, Nabelschnurblut-bzw.

Gewebe. Allogene

Stammzellen

k�nnen entsprechend gewonnen werden, sind aber mit immunologischen Nachteilen behaftet. Embryonale Zellen k�nnen verwendet werden, sind aber mit den entsprechenden Nachteilen behaftet.

In einer besonders bevorzugten Ausf�hrungsform kann der strukturierte Wachstumsprozess der kultivierten Zellen durch eine mit den erfindungsgem�-

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ssen Wachstumsfaktoren beschichteten Matrix induziert werden. Dazu kann die Matrix mit einem oder mehreren der genannten Wachstumsfaktoren sequentiell behandelt werden.

Sofern es sich um eine biologische Matrix handelt, ist es �blicherweise ein Implantat (Stent, Patch oder Katheter), ein Transplantat (z. B.Hauttransplan- tat), ein Tr�germaterial zum Wachstum von Zellen, z. B. ein sogenanntes Slowrelease Material (z. B. ein Hydrogel auf der Basis von Fibrin und/oder Polymere, wie z. B. Polylaktid oder Polyhydroxyalkanoat, und/oder Alginate), einKno- chenersatzmaterial (z. B. Tricalciumphosphat), ein allogenes, autologes oder xenogenes azellularisiertes oder nicht-azellularisiertes Gewebe (z. B. Herzklappe, Venenklappe, Arterienklappe, Haut, Gef�ss, Aorta, Sehne, Comea, Knorpel, Knochen, Trachea, Nerv, Miniskus, Diskus intervertebralis, Ureteren, Urethra oder Blase (siehe z. B. EP 0 989 867 oder EP 1 172120)), oder eine Matrix (z. B. eine Laminin-, Collagen IV-und/oder Matrigel-Matrix) oder vorzugsweise ein Feeder-Layer, wie z. B. CollagenI-, 3T3-und/oder MRC-5-Feeder Layer, oder ein Collagenfliess.

Die biologische Matrix wird vorteilhafterweise mit gewebespezifischen Zellen, Vorl�uferzellen, Knochenmarkszellen, peripheres Blut, Fettgewebeund/oder Fasergewebe, z. B. mit adulten Vorl�uferzellen aus dem Knochenmark, vorbesiedet. Die Vorbesiedelung f�hrt dazu, dass der Regenerationsprozess bereits in vitro einsetzt damit nach der Implantation der Matrix in den K�rper die Rege-nerationszeit in vivo verk�rzt ist.

Die verwendeten Matrices k�nnen noch zuvor aktiviert werden. Die Aktivierung der biologischen Matrix oder Tr�gerstruktur kann beispielsweise mittels Plasmaionisation, z. B. unter Verwendung von Wasserstoffperoxid, oder mittels Laseraktivierung erfolgen.

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Alternativ kann eine Beschichtung mit einer biodegradablen (Bio) polymerschicht, die den oder die genannten Wachstumsfaktor (en) enth�lt, vorgenommen werden. Hierzu eignen sich beispielsweise Fibrin, Plasma, Blut, Collagen und/oder Polylaktide.

Das erfindungsgem�sse Verfahren eignet sich insbesondere f�r adulte Zellen, d. h. prim�r differenzierte Zellen, die keinen embryonalen oder f�talen Ph�notyp mehr besitzen. Es eignet sich insbesondere f�r humane adulte Zellen, bei- spielsweise f�r adulteProgenitorzellen, gewebespezifische Zellen, vorzugs- weise Osteoblasten, Fibroblasten, Hepatozyten und/oder glatte Muskelzellen.

Neben einer Beendigung bzw. Reduzierung der Zufuhr der beschriebenen Wachstumsfaktoren zu der Kultur eignen sich zur Terminierung des erfindungs- gem�ssen Wachstumsprozesses auch Somatostatinund/oder TGF beta und/oder Prostaglandine.

Es ist besonders vorteilhaft, dass erfindungsgem�sse Verfahren lokal in vivo einzusetzen. Dazu k�nnen die Wachstumsfaktoren z. B. auf die Resektionsfl�- che eines Organs (z. B. einer Leber) aufgebracht werden. Sie k�nnen topisch oder aber �ber mit Hilfe eines Katheters lokal oder systemisch appliziert wer- den. Im Falle einer Leberresektion k�nnen sie alternativ oder erg�nzend vor, w�hrend oder nach dem Eingriff appliziert werden. Ebenso ist es m�glich, die Wachstumsfaktoren (z. B. zur F�rderung derKnorpelregeneration) unmittelbar in das betroffene Gewebe oder Gelenk zu injizieren. Damit k�nnen die Wachs- tumsfaktoren �ber die Synovialfl�ssigkeit direkt auf die Bildung einer neuenKnorpelstruktur wirken.

In einer besonderen Ausf�hrungsform k�nnen zus�tzlich zu den h�matopoieti-

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schen Wachstumsfaktoren einer oder mehrerer der folgenden Wachstumsfaktoren verabreicht werden : "Transforming Growth Factor beta" (TGF beta), Prostaglandine,Granulozyten (-Makrophagen)-stimulierender Faktor (G (M)CSF), "Growth Hormone Releasing Hormone" (GHRH),"Thyrotropin-releasing Homone"(TRH),"Gonadotropin-releasing Hormone" (GnRH),"Corticotropinreleasing Hormone" (CRH), Dopamin, "Antidiuretic Hormon" (ADH), Oxytocin, Prolactin, Adrenocorticotropin,beta-Celltropin, Lutrotropinund/oder Vasopressin verwendet bzw. zus�tzlich ein oder mehrere Nervenregenerationsfaktoren, vorzugsweise"nerve growth factor" (NGF)und/oder ein oder mehrere Gef�ssregenerationsfaktoren,vorzugsweise"Vascular Endothelial Growth Factor" (VEGF)und/oder"Plateled Derived Growth Factor" (PDGF).

Die h�matopoietischen Wachstumsfaktoren parenteral als injezierbare Mikrosph�ren, erodierbare Partikel, Polymerverbindungen (mit Polypeptid, Polyglycols�ure), Liposomen und kleine Partikel appliziert werden. Injezierbare oder implantierbare Drug Delivery-Ger�te sind ebenso m�glich. Die Stoffe k�nnen auch inhaliert werden, subkutan, intramuskul�r gespritzt werden oder-f�r die topische Applikation-als kutanes Pflaster gegeben werden.

Begleitend k�nnen Substanzen mit den Pflastern vermischt werden, die eine lokale Hyper�mie erreichen und dadurch dieHautpermeabilit�t erh�hen (z. B.

Bienengift). Hyperionische Strukturen mit und ohne direkte EPO Kopplung bzw.

Beschichtung der Salze k�nnen durch die Hautbarrieren besser transportiert werden und k�nnen mit bevorzugt positiv ionisierenden Strukturen verbunden werden. Auch negative lonisation ist m�glich. Die Faktoren k�nnen mit Mandel�l bzw. Jojoba�l zur Transportverbesserung durch Schleimh�ute im Darmbereich bzw. der Haut verwendet werden.

Eine Verbindung mit Polyethylenglykol (PEG) ist m�glich, um Transportbarrie-

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ren (Mucosa im Mund, Magen, Darm ; Schleimh�ute, Hornhaut) zu �berwinden.

Es ist bekannt, dass aus Proteinen Mischpr�parationen vorbereitet werden k�nnen. Suspensionen,Gelimulsionen, Feststoffverbindungen, dehydrierte oder lyophilisierte Puder sind m�glich. Die Wachstumsfaktoren k�nnen auf Partikeln absorbiert werden oder enkapsuliert werden.

Es kann besonders vorteilhaft sein, Stammzellen (Progenitoren im eigentlichen Sinne) gemeinsam mit EPO/TPO zur Geweberegeneration einzusetzen, um damit das Recruitment der Gewebezellen aus den 4 Grundgewebearten f�r den Regenerationsprozess deutlich zu beschleunigen. EPO/TPO sowie die anderen genannten Faktoren k�nnen gemischt mitStammzellen und z. B. Fibrinkleber als Tr�germatrix appliziert werden. Bei Bedarf kann die Tr�germatrix weggelassen werden bzw. durch eine st�rker vorstrukturierte und geformte Tr�germatrix ersetzt werden. Die Faktoren k�nnen auch ohne jegliche biologische Tr�germatrix z. B nur in w�ssrigrer Suspension systemisch oder topisch verabreicht werden.

Die erfindungsgem�sse Gabe von EPO verbessert diese Geweberegeneration durch gewebespezifische Pr�gung derStammzellen und Differenzierung im Anschluss an eine Vermehrung und Integration und koordiniert das Wachstum in Bezug auf die Grundgewebearten.

I.

Anwendungsbereiche 1. Plattenepithelien Erfindungsgem�ss wird EPO eingesetzt, um die Ausbildung von Basalmembra-

nen (extrazellul�re St�tzschicht unter Epithel) zu f�rdern. EPO unterst�tzt die Ausbildung des Grenzbereiches der Papillen.

EPO wird erfindungsgem�ss eingesetzt, um die Ausbildung vonDr�senepithel zu unterst�tzen. EPO f�hrt zur Regeneration plattenf�rmiger isoprismatischer und prismatischer Epithelien (Plattenepithelium �sophagus, hochprismatischesEpithel im Samenleiter, �bergangsepithel der Harnblase).

Durch EPO kommt es im strukturellen Wachstumsprozess zur Wiederausbildung der Desmosomen, d. h. der Verbindungsst�cke zwischen den Zellen und deren Anheftungsstrukuren. Es kommt auch zur Ausbildung von sogenannten Mikrovilli auf den Epithelien, zum Beispiel des D�nndarms (Nebenhoden, Luftr�hre).

EPO hat einen direkten Effekt auf die Regeneration des einschichtigen Platte-nepithels, der Endothelauskleidung von Herz-, Blut-und Lymphgef�ssen und des hochprismatischenEpithels (Magen, D�nn-und Dickdarm, Gallenblase, Eileiter, Uterus). EPO wird erfindungsgem�ss eingesetzt, um das zweireihigeEpithel (Speicheldr�sen der Mundh�hlen, Tr�nennasengang, Nebenhodengang, Samenleiter) auszubilden. EPO wird erfindungsgem�ss auch f�r das hochprismatischeEpithel (Nasenh�hle, Epipharinx,Kehlkopf, Luftr�hrenbronchialbaum, Harnr�hre, Ohrtrompete), weiter zur Ausbildung von unverhorntem und verhorntemPlattenepithel eingesetzt. Derstrukturf�rdernde Aspekt auf die Parenchymregeneration des EPO unterst�tzt die Ausbildung exokriner Dr�sen. Hierzu z�hlen unter anderem das Pankreas, Dr�sen im D�nndarmepithel (Becherzellen, Unterkieferspeicheldr�se, Inselzellen zur Insulinproduktion). EPO unterst�tzt die Regeneration der endokrinen Dr�sen.

2. Bindegewebe

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EPO kann dieGrundbestandteile des Bindegewebes in Koordination mit den umgebenden Parenchymdr�senstrukturen wiederherstellen. Die Grundbestandteile, die hiervon beeinflusst werden, sind die Grundsubstanz(Glucosami- noglycane), die Koordination mit sogenannten Plasmazellen, Fettzellen, Blutgef�ssen und darum liegenden glatten Muskelzellen, daneben die Bindegewebszellen, Fibroblasten, Mastzellen und Kollagenfasern sowie die Elastinfasern und dazwischen eingef�gte Makrophagen- (ebenso Kupffer, Pit, Itozellen bei der Leber) undKapillarenendotheizellen. Kapillaren haben, nur eine Endothelzellenauskleidung.

Hierbei hat EPO jedoch einen breiteren koordinativen Aspekt auf das geschilderte Mikromilieu. Dieses wird durch traumatische Verletzungen in einen Initiatorzustand versetzt. Therapeutisch kann EPO erfindungsgem�ss gegeben werden, wenn nach traumatischen Verletzungen dieseInitiationskaskaden beschleunigt werden sollen. EPO unterst�tzt hierbei erfindungsgem�ss als Katalysator und systemischer und topischer Vermittler der Geweberegeneration den durch Makrophagen regional ausgel�sten immunmodulatorischen Effekt, der in Makrophagen in Verbindung mit Plasmazellen die immunologische Modulation und Freisetzung von Interleukinen und Zytokinen beinhaltet. Durch diese erfindungsgem�sse Interaktionskompetenz wird die hohe Regioselektivit�t der therapeutischen Gabe von EPO/TPO am Bedarfsort (Trauma, Entz�ndung, Automimmunerkrankung) erreicht.

EPO koordiniert in der therapeutischen Anwendung erfindungsgem�ss diese regionale Immunstimulation mit der systemischen endogenen Antwort. EPO f�rdert dadurch das Anlaufen der Entz�ndungsreaktion im Sinne einer Kaskadenbeschleunigung als therapeutischen Effekt. Es erh�ht die Freisetzung von endogenen Wachstumshormonen und kontrolliert damit auch dessen Nebenwir-

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kungspotential. Eine systemische Gabe von Wachstumshormonen wird dadurch vermeidbar und dessen unkontrollierter Effekt bez�glich einer potentielle Tumorogenizit�t im Rahmen der physiologischen Wirkungssituation vermieden.

Bindegewebsstrukturen k�nnen erfindungsgem�ss wiederhergestellt werden.

Hierzu z�hlen kollagene Fasern, retikul�re Fasern, zum Beispiel Lymphknoten, elastische Fasern und die Ausbildung der Grundsubstanz (Proteoglycane, Glycosaminoglycane, Hyalurons�ure, Chondroitinsulfate, Dermatansulfat, Keratansulfat, Heparansulfat, Heparin). Die modulierten Bindegewebszellen sind die Fibroblasten, Retikulumzellen, insbesondere inlymphatischen Geweben und Organen, Mesenchymzellen, Fettzellen, Monozyten und Makrophagen. Es ist bekannt, dass Monozyten sich zu Makrophagen differenzieren k�nnen. EPO kann die Makrophagenabwehr in der Entz�ndung und bei Infektionsreaktion hinsichtlich der nachfolgenden und notwendigen Gewerbereparatur und 3-DRegeneration beschleunigen.

Die chemotaktischen Funktionen der Makrophagen werden durch EPO mitkoordiniert. Die ortsst�ndigen, im Bindegewebe befindlichen Monozyten k�nnen in das Geweberecruitment durch EPO hineingezogen werden, wodurch diese im Sinne von systemisch und lokal verf�gbaren Progenitoren und f�r eine ortsst�ndige Reparatur direkt beitragen k�nnen.

EPO koordiniert die Funktion des retikoenterialen Systems (RES). Dieses wird in einem Netzwerk retikul�rer Fasern zusammengeschlossen und bezieht dieEndothelzellen von Leber, Milz und Knochenmark mit ein. Daneben werden durch EPO die Lymphozytenaktivit�t, die der Plasmazellen, Makrophagen undimmunmodulatorisch-die der Mastzellen koordiniert.

Im Anschluss

an traumatische Vorg�nge koppelt EPO die an sich bekannten

Einzelfunktionen dieser Zellen mit dem Strukturaufbau und der regioselektiven Geweberegeneration. Danach kommt es �ber R�ckopplungseffekte zum Abklingen der Entz�ndungsreaktionen und damit auch zu einem Abklingen von Autoimmunph�nomenen, die auch �ber Antik�rperbildung vermittelt werden k�nnen. Hierbei wird EPO erfindungsgem�ss therapeutisch als Medikament genutzt.

Bei der Geweberegeneration kommt es zur Ausbildung von Bindegewebsstrukturen und dem Aufbau lockerer Bindegewebsstrukturen (Subkutis der Haut, bei Hohlorganen, wenig spezialisiertes Bindegewebe). EPO f�hrt zur Ausbildung des Bindegewebes (ungeordnetes und geordnetes Bindegewebe, der Ausbildung in B�ndern, Ligamenten, Faszien, Sehnen und der Koordination mit elastischen Strukturen und deren dreidimensionaler Vernetzung, die gewebespezifisch vermischt oder auch gallertartig ausgepr�gt wird).

EPO unterst�tzt den Aufbau derRetikulumzellen, die insbesondere das retikul�re Bindegewebe wiederherstellen. EPO unterst�tzt den Aufbau des Fettgewebes und der darin eingeordneten Progenitoren durch Recruitment und Einsatz der Propagationsfunktionen des EPO.

Durch die erfindungsgem�sse Wirkung kommt es zur Verbesserung der St�tzfunktionen und der Kraft�bertragung dieser Bindegewebskomponenten. Es kommt zur Verbesserung des Stoffaustausches, da das Bindegewebe K�rpergef�sse f�hrt. Es kommt zur Verbesserung der Speicherfunktionen der Bindegewebsstrukturen mit einer Einlagerung von Lipiden,Glycosaminoglycanen.

EPO f�hrt therapeutisch zur Verbesserung der Wasser-undElektrolytfunktion.

Es kommt durch EPO zur Verbesserung der Schutzfunktion, da es zum Wiederaufbau mechanischer Barrieren gegen�ber pathogenen Krankheitserregern

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kommt. Es kommt zu reparativen Prozessen im Anschluss an Entz�ndungen, da die Gewebsstrukturen wiederhergestellt werden. EPO unterst�tzt erfindungsgem�ss die Parenchym-und Strukturregeneration.

Dies ist im Unterschied zu sehen mit der Ausbildung vonGranulationsgeweben (wie diese f�r eine sogenannte Wundheilung charakterisierend sind), die im Sinne einer Wundheilung zu Ersatzgeweben und damit lediglich zu Ersatzfunktionen f�hren. Hierunter versteht man die Ausbildung von Narbengeweben und lockeren fasrigen Geweben, die eine Defektdeckung erreichen k�nnen, die jedoch mit hohen funktionellen Verlusten verbunden sind. Erfindungsgem�ss besitzt EPO hier einenstrukturbildenden Prozess im Sinne der Wiederherstellung des ehemaligen Gewebes. In besonders grossen Defekten k�nnenKombinati- onen mit Platzhaltermaterialien jedoch den strukturbildenden Prozess unterst�tzen und f�rdern (morphologisch und funktionell). Dies hat grosse Bedeutung f�r das Tissue Engineering, da jegliche zur Integration verwendeten scaffold Materialien (z. B. Tr�germaterialien f�r Gef�sse, Herzklappen, Transplantate) mit EPO kombiniert werden k�nnen. Permanente Implantate (nicht biodegradable Materalien) k�nnen zur besseren Gewebeintegration beschichtet werden (z. B. metallische und keramische Prothesen).

3. Blutgef�ss-undLymphkreislaufsystem EPO f�hrt zu einer Wiederausbildung des Blutgef�sssystems und auch der gro- ssen Blutgef�sse-nicht nur der Kapillarstrukturen, wie bisher bekannt. Zu den Strukturen der grossen Blutgef�sse geh�ren auch die Venen und Arterien (grosser und kleinerK�rperkreislaufl.

Weiterhin erm�glicht EPO Regenerationsprozesse innerhalb von Gewebestrukturen, die auch das Lymphkreislaufsystem betreffen, und der Lymphge-

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f�sse selbst. Die Wiederherstellung durch EPO-Integration betrifft nicht nur die Tunica Intima, das Endothel, sondern vor allem auch die Tunica Media, die aus Bindegewebe und Muskelzellen besteht. Weiterhin die Tunica Externa, die eine l�ngslaufendeBindegewebslage bildet. Wichtig bei der Ausbildung der Gef�sse sind die verschiedenen Typen der Arterien. So gibt es Arterien vom elastischen muskul�ren Bautyp und unterschiedliche Bindegewebsstruktur, die durch regenerative Prozesse mitinduziert werden, n�mlich die Membrana Elastica Interna und die Membrana Elastica Externa, sowie die Ausbildung vonvasovasalen Gef�ssen. Hierbei werdenFettzellen in die Wandschichten integriert. Bei den Arterien vom elastischen Bautyp erm�glicht EPO die Regeneration der Membrana Elastica Interna neben der Tunica Externa mit den Vasovasolen. Bei den Arterien vom muskul�ren Bautyp, Querschnitt 0,1 bis 7mm, erm�glicht EPO eine kr�ftige Ausbildung der glatten Muskulatur in der Media. Weiterhin erm�glicht EPO die Ausbildung dersubendothelialenBindegewebslage. Es kommt zur Wiederherstellung typischerAufbauformen, wie der Tunica Intima, wie bisher bekannt als Endothelzell-Komponente, aber auch vor allem der Membrana Elastica Interna, den elastischen Phasenstrukturen, Muskelzellen, Tunica Media, MembranaEtastica und Tunica Externa. Auch r�umlich geometrische Anordnungen wie die Ausbildung muskul�rerVenolen im Bereich begleitenderVenolen in einer spezifischen geometrischen Anordnung der Nachbarschaft werden durch die therapeutische EPO Gabe erm�glicht.

Es handelt sich nicht um 2-dimensionale Verbindungsprozesse mit einem Konglomeratbildungs-Schub, sondern um spezifische 3-dimensionale Strukturbildungsprozesse. EPO und TPO sind erfindungsgem�ss somit nicht mit den bekanntenProliferationsfaktoren im Sinne klassicher Wachstumsfaktorengleichzustellen, sondern wirken eher im Sinne"3-D Regenerationsfaktoren".

�hnliche Ergebnisse finden sich im Bereich der EPO-Stimulation bei Venen mit

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der Ausbildung der Tunica Intima, Tunica Media und Tunica Adventitia. Weiterhin k�nnen dieVenenklappenstrukturen insbesondere in Verbindung mit scaffold Materialien in geometrische Formen regeneriert werden, oder auch scaffolds soweit dies in gr�sseren Gef�ssbereichen nach traumatischen Verletzungen und degenerativen Prozessen m�glich ist.

Bei gr�sseren Volumendefekten k�nnen unter Umst�nden Tr�germaterialien mit implantiert werden, so dass die EPO-Wirkung auf denRemodelling-Prozess und die Integration in den Gesamtorganismus fokussiert wird. Bei kompletten regenerativen Prozessen vor allem bei parenchymat�sen Strukturen werden diese Gef�sse jedoch mit gebildet.

Es gibt keine Beschr�nkung auf verschiedene Gef�ssstrukturen, z. B. arteriven�seAnastomosen. In Verbindung mit einer therapeutisch gegebenen EPOGabe k�nnen insbesondere auch altersbedingte Ver�nderungen der Blutgef�sse und degenerative Strukturen revidiert werden. Im Alterungsprozess kommt es zur Ausbildung glatter L�ngsmuskulaturstrukturen. Degenerative Prozesse bedeuten nach dem Bauprinzip der Gewebsstrukturen angelegte Neostrukturbildungsaktivit�ten. Diese k�nnen als de novo hergestellte Gef�sse in Gewebsstrukturen aufgebaut werden und sind nicht prim�r pathologisch ver�ndert.

Die Entz�ndungsreaktionen k�nnen mittels EPO-Gabe erfindungsgem�ss modelliert werden. Mittels EPO-Gabe gibt es Regenerationsprozesse im Bereich des Endokards wie auch des Myokards. Das Epikard ist ein Blatt des Herzbeutels, das durch EPO-Gabe in eine Regeneration gef�hrt wird. Das parietal Blatt Perikard stellt eine seri�se Membran dar, die aus einerMesotheizell- schicht, die auf einer Bindegewebslage ruht, besteht. Im Bereich des Herzens kommt es zu einer Regeneration derHerzventile und auch der Chordae tendin�e insbesondere dann, wenn Strukturhilfen (scaffolds) in Verbindung mit

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Stammzellbesiedelung und EPO-Gabe herbeigef�hrt werden. Die Wiederausbildung des Reizleitungssystems kann nach regionaler Zerst�rung erfolgen.

Hierzu z�hlen auch Purkinjefasern, sowie der Atrioventikul�r-Knoten, der auch repariert werden kann. Zus�tzlich werden Lymphgef�sse, Nerven, Herzgeflechte, Koronaarterien-Strukturen miteinander kombiniert.

Der Aufbau der Lymphgef�sse und Lymphkapillaren erfolgt durch EPO-Gabe entsprechend der normalen Form-undSammelgef�sse (Tunica Intima, Tunica Medica und Tunica Adventitia). Regenerative Prozesse k�nnen auch den Bereich des Ductus thoraticus betreffen.

Klappen-undSammelgef�sse stellen Falten dar, die ebenso bei strukturellen Aufbauprozessen mitintegriert werden. Beim Blutgef�sssystem kommt es zu einer Aktivierung von Angioplasten, die zum Teil aus peripheren, aber auch regionalen Progenitorenrekrutiert werden. Zun�chst kommt es zur Anlage von Kapillaren, die aus Endothel-Zellstrukturen bestehen. Wichtig im Anwendungsbereich von EPO ist jedoch, dass der Strukturaufbau initiiert werden kann, indem die nachgeschalteten muskul�ren Strukturen und Bindegewebsstrukturen aufgebaut werden.

Das Reizleitungssystem spielt eine grosse Rolle f�r die Koordination der EPO Wirkung, da es Interaktionen zu den modulierenden Zellen und Knoten gibt.

Zu den Zellen des Immunsystems geh�ren Lymphozyten, Makrophagen,Plas-mazellen, Stammzellen. Das Maschenwerk retikul�ren Bindegewebes verbindet die Zellen desImmunapparates im Immunsystem. Durch EPO-Gabe kommt es zu einer beschleunigten Reparatur des retikul�ren Bindegewebes, der Retiku-lumzellen und der Retikulumfasern. Ebenso k�nnen Thymusstrukturen wieder repariert werden. Histologisch werden dort Rinden-und Markstrukturen wieder-

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hergestellt. Histologisch kommt es bei der EPO-Gabe zu einer Regeneration auch von Lymphknoten, die wiederumIntermedi�rsinus, Marksinus-, Randsinus-, Kapsel-und Bindegewebssepten, aber wie auch abf�hrende Lymphgef�sse, Lymphkn�tchen oder Markstr�ngen ausbilden k�nnen.

Die histologische Organisation entspricht nach erfolgtem Reparaturprozess und der koordinierten Zusammenfassung einer �blichen Struktur mit Kapsel-und Bindegewebssepten, Hilusbindegewebe und zuf�hrenden/abf�hrenden Lymphgef�ssen,Lymphkn�tchen, Markstr�ngen und abf�hrendenLymphgef�ssen.

Regenerative Prinzipien k�nnen auch im Bereich der Milz zu einer Wiederherstellung der normalen Kapsel, derPartikelstrukturen und des Hilus f�hren.

Weiterhin finden wir f�r die Wiederherstellung der weissen Pulpa Malpighik�rperchen derMilzsinusplatten in den Milchstr�ngen. Der Blutkreislauf der Milz wird wiederhergestellt, wobei Arterien derMilz, Milzsinusvenen und Pulpavenen zusammen gef�hrt werden. Die weisse Pulpa und die Verbindung der Lymphscheiden wird wiederhergestellt.

Durch EPO Gabe nach Verletzungen kommt es zu einer dreidimensionalen Interaktion derBasalmembranen, der Retikulumzellen, derRetikulumfasern und der Erythrozyten. Es kommt zur Ausbildung offener und geschlossener Kreis-laufsysteme. Hierbei ist die Interaktion mit Makrophagen, die aus Knochenmarkszellen entstehen k�nnen, von Bedeutung, um endogene Kaskaden innerhalb des K�rpers und der Vermittlung von Wachstumsmediatoren (Wachstumshormon) initiieren zu k�nnen.

4. Haut/Cutis Reparative Prozesse nach Verbrennungen, Trauma, Verbr�hungen, mechani-

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schen Verletzungen oder Entz�ndungen im Bereich der Haut sind sehr vielf�ltig. Durch Gabe von EPO oder TPO kann mit und ohne strukturelle Ersatzstrukturen eine Regeneration erreicht werden.

Insbesondere bei chronischen Erkrankungen, Durchblutungsst�rungen, diabetischen Ulzera, Ph�nomenen auch immunologischer Natur kann EPO hier rnodellierend eingreifen. Histologisch gesehen kommt es zu einerWiederausbil- dung einer normalen Epidermis, Dermis und einer Subkutis, die eine entsprechende Vaskularisation mit Makrostrukturen erreicht. An den Handfl�chen und Fusssohle kommt es zur Ausbildung des stratum basale, stratumgranulosum, stratum lucidum, stratum coneum. An der Dermis und der Aussenseite kommt es zur Ausbildung von Dermispapillen. An der Epidermis (innere Oberfl�che) werden die entsprechenden Epidermisvertiefungen wieder ausgebildet. Zus�tzlich werden Anhangsgebilde und deren Ausbildungen aus Progenitoren mitunterst�tzt. Ein Problem beim bisherigen Tissue Engineering war die Verbindungstruktureller Reparatur mit der Ausbildung vonHautanhangsgebilden im Bereich der Haut.

Durch Gabe von EPO k�nnenInteraktionsprozesse im Bereich des Melanozytensystems des Menschen erreicht werden. Physiologische R�ckkopplungsprozesse zwischen Augen, Hirnhaut und der Ausbildung der Pigmentierung werden ber�cksichtigt, da es sich hier nicht um isolierteZellverbindungen, sondern organtypische Regenerationsprodukte handelt.

Reparative Prozesse des dermalen Anteiles beinhalten muskul�re Strukturen(musculus arector pili), taktile Strukturen, �ussereWurzelscheide der Haare und innereWurzelscheide und auch die Haarzwiebeistruktur. Diese ragt unter Umst�nden in das Fettgewebe hinein. Bei den Haaren undHaarfollikeln kornmt es zur Ausbildung von bindegewebigenWurzelscheiden, die eine wichtige Funkti-

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onsstruktur in der Regeneration beinhaltet. Daraus bilden sichGlashaut, �u- ssereWurzelscheide, innereWurzelscheide und das letztendliche Haar.�hn- liche Prozesse k�nnen im Bereich derNagelregeneration unterst�tzt und herbeigef�hrt werden. Innerhalb der Gewebestrukturen werden Schweissdr�sen mit ausgebildet. In den Hautstrukturen werden perifollikul�re Netzstrukturen, Netze, subkapill�re Arteriennetze,termale Venennetze wieder ausgebildet.

5.Verdauungssystem Durch die EPO-Gabe kommt zur Wiederherstellung der innersten Schicht der Schleimhaut, Tunica mukosa und der Bindegewebsschicht der sogenannten Lamina propria. Die tiefste Schicht bildet eine Lage glatter Muskulatur die Laminamuskularis mukosae. Der Schichtaufbau wird wie folgt : Serosa-Zellen dannMuskularis, Submukosa und Mukosa. Diese Strukturen werden durch Verdauungsdr�sen durchzogen und Schleimhautdr�sen befinden sich in der Mukosa. Zus�tzlich regenerieren Submukosadr�sen und der Plexus myintericus (Auerbach) und der Plexus submukosa (Meissner). Im Bereich der Zunge regenerieren die blattf�rmigen Papillen. Im Bereich der Mundes werden im Bereich der Gewebsregeneration auch Geschmacksknospen mit regeneriert.

Diese sind aufgebaut ausBasalzelle Typ 4, St�tzzelle Typ 1,Rezeptorzelle Typ 3, Glykoproteine und Geschmacksporen. Die seromuk�se Speicheldr�se besteht ausStreifenst�cken,Schaltst�cken, muk�sen Endst�cken, Basalmembranen, myoepitelialenKorbzellen und ser�sen Endst�cken. Wichtige reparative Prozesse k�nnen bei Paradontose auch im Bereich des Zahnbereichs erfolgen. Zum Beispiel betrifft das die Strukturen des Periodontiums in Verbindung mit demAlveolarknochen und dem Wurzelkanal mit Apex. Die reparativen Prozesse k�nnen durch Hinzuf�hrung vonstammzellbesiedelten Cal-ziumphosphatstrukturen oder anderen mineralischenErsatzmaterialien, die mit EPO beschichtet werden, erreicht werden. Die von EPO unterst�tzte Ausbil-

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dungen eines Regenerationsprozesses erfolgt im Bereich von Zysten im Bereich der Kieferh�hlen, Unterkieferstrukturen, nach Wurzelentfernung und Neureparatur dieser Strukturen vor Ort in vivo.

Die entsprechenden Materialien undOdontoblasten k�nnen in vitro ebenso durch EPO-Gabe vorbereitet werden.

Osteochondrale

Strukturen wie zum Beispiel der

osteochondrale

Zylinder k�nnen in vitro vorbereitet und vivo unter EPO-Gabe wachstumsregenerationsf�rdernd implantiert werden. Die Ausbildung der

Wurzelkanalstrukturen

mit Neoinnervation wird �ber EPO beschichtete Leitstrukturen, die hineingegeben werden, gef�rdert. Hier helfen Molek�le der

extrazellul�ren

Matrix, die in Beschichtungsprozessen auch als Peptidstrukturen herbeigef�hrt werden k�nnen.

Die Schmelzorganstrukturen zusammen mitPulpaodontoplasten, Zwischenzonenschmelz-Pulpa k�nnen im Wachstumsprozess nach Verletzungen und traumatischen Prozessen unterst�tzt werden. Die reparativen und regenerativen Prozesse fokussieren sich auf den Bereich des umgebenden Bindegewebes und die Integration der Zahnstruktur oder auch eines Implantates im Bereich des Kiefer. Das Pulpa-Bindegewebe und die Ausbildung mit Blutgef�ssen, die den Apex des Wurzelkanals ein-und ausd�mmen, spielt hier eine grosse Rolle f�r die Innervation. Das Peridontium(Wurzelhaut) wird so regeneriert. Die Sharpeyfasern durchziehen die Wurzelhaut und sind im Zement bzw. Alveolarknochen verankert.

EPO f�hrt zur regenerativen Prozessen in diesem Bereich nach Entz�ndungen und traumatischen Reaktionen. Im Bereich des Zahnfleisches kommt es durch EPO-Gabe bei Entz�ndungsph�nomen bei Paradontose zur Verbesserung des reparativen Prozesses.

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Schlund : Regenerative Prozesse k�nnen auch durch EPO-Gabe auf den Pharynxbereich in der Wiederherstellung desplasmatischen Mehrreihenepithels ausgedehnt werden. Auch hier k�nnen Tunicamuscularis und Tunica adventitia koordiniert wiederhergestellt werden. In den Lymphozytenstrukturen innerhalb der Gau-menmandel werdenKryptastrukturen und Kapselstrukturen wiederhergestellt.

Regenerative Prozesse k�nnen auch entz�ndete Strukturen, wie bei Tonsillitisregioselektiv in der Regeneration f�rdern.

Rumpf/Darm

: Im Darmbereich gibt es hochregenerative Epithelanteilen, die sich innerhalb von 24 bis 48 Stunden erneuern k�nnen. Bei Entz�ndungsreaktionen kommt es zu einer St�rung dieser reparativen T�tigkeit, so dass unterst�tzende Effekte durch EPO/TPO hier eine Kompensationsreaktion des K�rpers erm�glichen k�nnen. Hierdurch kommt es zur Wiederausbildung von

Epithelstrukturen

wie Lamina propria, Tunica mucosa ; Lamina

muscularis

mucosae, Tunica submuscosa, Ringmuskulatur, Tunica

muscolaris

und L�ngsmuskulatur und Tunica adventitia, die als reparative Prozesse den gesamten Darmwandbereich durchziehen w�rden, so dass eine selektive, oberfl�chliche auch

intramurale

und

tiefmurale

Regeneration erm�glicht wird. Diese Prinzipien k�nnen �ber den gesamten Bereich des Magen-Darm-Traktes beginnend von Schlund, Mund bis in die Speiser�hre und in den Enddarm fortgef�hrt werden. Im �sophagus k�nnen die Laminamuscularis mucosae, Lamina propria und das mehrschichtige Plattenepithel regeneriert werden. Ser�se Strukturen werden integriert und durch EPO Gabe repariert.

Der Wiederaufbau der Magenwand insbesondere der Bereich der Areae gastrici mit Magengr�bchen, Magendr�sen, Laminamuscularis mucosae, an den Au- ssenseitenMesothel, dann subser�ses Bindegewebe, Tunica muscolaris, Tu-

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nica submucosa und Tunica mucosae ist m�glich. In den Strukturen werdenBelegzellen, Magendr�sen,Hauptzellen, Lamina propria,muscularis mucosae und Tunica mucosae regeneriert, ebenso dasOberfl�chenepithel. Regenerative Prozesse auch im Bereich der Zellen des Corpusfundus-Dr�senbereiches beinhalten die Wiederausbildung vonHauptzellen. Die Verbindung zuBelegzellen ist gegeben. Die durch EPO erfindungsgem�ss erreichte Stimulation beinhaltet auch die Regeneration von Zellen die vasoaktive Substanzen wie Polypeptide freisetzen und die Bildung derenterochromaffinen Zellen (ECN), die Serotonin freisetzen. Magendr�sen k�nnen regeneriert werden. Es ist bekannt, dass sich dasOberfl�chenepithel des Magens innerhalb von drei Tagen erneuern kann.

Bei starken traumatischen, entz�ndlichen Verletzungen, Regenerationsst�rungen hilft die Gabe von EPO diese Regenerationsf�higkeit wiederherzustellen.

Im Bereich des D�nndarms kommt es zurWiederausbildung der Lamina propria, der Lamina muscolaris mucosa, derSolit�rfollikel, der Tunica submucosa, der Ringmuskulatur, derL�ngsmuskulatur, der Tunica serosa. In den Strukturen werden die Darmzotten wieder ausgebildet und ebenso das Solit�rfollikel und die Kerkringschen-Falten. Ebenso werden die Krypten wiederhergestellt. Die Krypten enthalten sogenannte Panethzellen. Diese k�nnen Sekretgenerat im Dr�sengrund ausbilden.Peyerscheplaques befindet sich in der Lamina propria des Duodenums. Die Endst�cke der Brunnerschen Dr�sen zeigen nach EPO Regeneration charakteristische muk�se Zellen, ein hellesZytoplasma und an der Zellbasis liegende flache Zellkerne. Die Dickdarmregeneration bei EPO Gabe spielt insbesondere nach operativen Entfernungen eine wichtige Rolle.

6. Skelett EPO f�hrt zur Regeneration desSkelettgewebes mit der Unterteilung in straffes collagenes Bindegewebe, Knorpelgewebe und Knochengewebe. Bei den Chondrozyten f�rdert EPO die Ausbildung der interzellul�ren Substanzen und

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f�hrt zu funktionellen Verbesserungen, der Chondrozytenstrukturen. EPO unterst�tzt die Ausbildung der Wachstumszonen und die Ausbildung des Perikondiums (umgebende Bindegewebsstruktur, Ausnahme Gelenk) nach traumatischen Effekten. Bei Erwachsenen k�nnen sich Knorpelzellen bekannterweise nicht mehr vermehren, da die Knorpelbildungsaktivit�t des Perikondiums auf die Zeit des K�rperwachstums vor demErwachsenenalter beschr�nkt ist. Durch Gabe von EPO k�nnen diese Regenerationsprozesse therapeutisch beeinflusst und die ansonsten auftretende Bildung von Bindegewebszellen als Defektf�llmaterial vermieden werden. Teilweise k�nnen hiermit der plastische Prozess, d. h. die Umbildung von Fibroblasten und Chondrozyten in dem Recruitment der EPO-Gabe eine Rolle spielen. Therapeutisch wird EPO eingesetzt in der Regeneration von Knorpelstrukturen, wie z. B. hyaliner Knorpel im Bereich der Gelenkfl�chen f�r dieKehlkopfenden, Luftr�hre, Bronchien und einen Teil des Nasenskelettes. Erfindungsgem�ss f�rdert EPO die Bildung der Knorpelkapseln und die Ausbildung derProteoglycane/Kollagene. Erfindungsgem�ss ist eine Verbindung mitStammzellen m�glich. Aber auch isoliert wird EPO eingesetzt, um elastischen Knorpel zu regenerieren, der z. B. imKehldeckel-Knorpelbereich lokalisiert ist. Hierzu z�hlen auch die Knorpel des �usseren Ohres und der Ohrtrompete. EPO wird erfindungsgem�ss eingesetzt, um auchFaserknorpel im Verbindungsbereich von Gelenken wiederherzustellen. Hierzu z�hlen die Regenerationsprozesse im Bereich der Zwischenwirbelscheiben, intraartikul�ren Forts�tzen, Scheiben und Menisken. Erfindungsgem�ss k�nnen im adulten Organismus die ansonsten verlorenen regenerativen Ver�nderungen des Knorpels wieder aktiviert werden, die Regeneration, der Neuaufbau und die Proteoglycan/Collagensynthese der Chondrozyten wieder beginnen. Die Verkalkung des Knorpels kann an den nicht erw�nschten Stellen verhindert werden.

Erfindungsgem�ss f�hrt EPO in therapeutischen Bereichen zur koordinierten 3D Regeneration von Knochengewebe alsKomplettstruktur inkl. der Gef�sse. Bei

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gr�sseren Defekten k�nnen Ersatzstrukturen anorganischer oder biologischer Tr�germaterialien eingef�hrt werden. Hier kann eine Kombination zwischen phasenreinem Tricalziumphosphat und einer EPO-Beschichtung durchgef�hrt werden.

Alternativ k�nnen Hydroxyl-Appatite oder auch biologischer Knochen allogenen oder xenogenen Ursprungs nach entsprechender Behandlung entsprechend eingesetzt werden. Erfindungsgem�ss wirkt die Gabe von EPO, auf das Periost und Endost und f�hrt zu einem Recruitment und Vermehrung der dort befindlichen Progenitoren. Danach kommt es zur Ausbildung von Lamellen,Ausbil- dung von Osteozyten und der entsprechenden Lakunen und Kanalikuli. Erfindungsgem�ss wird EPO zur Knochenregeneration eingesetzt, und es kommt zur Ausbildung der Haverskan�le,Knochenkan�lchen derSchaltlamellen, der Lakunen, konzentrische Lamellen, die eine benachbarteLamellensystemabgren- zung und Verbindung erm�glichen. �berraschenderweise werden VolkmannKan�le als kn�cherne Strassen f�r die Blutgef�sse gefunden. EPO stimuliert dieOsteoprogenitoren-Induktion, Osteoblasten, Osteozyten undOsteoklasten.

EPO f�hrt bei Osteoblasten zu einer Neosynthese und Induktion der Interzellu-l�r-Substanzen des Knochens. DieGewebebildung beinhaltet die Ausbildung von knochenspezifischen Zellen. EPO f�rdert die Ausbildung von Ossifikati-onskan�len und die Ausbildung von Knochenb�lkchen und die Integration vaskul�rer Bindegewebsstrukturen. Ausgehend von Verletzungen, z. B. Unf�llen, Trauma aber auch Entz�ndungsreaktionen, kann EPO die Koordinationsaufgaben in der Wiederherstellung der Gewebestrukturen �bernehmen, so dass Zonen von Knorpelabbau, Knochenneubildung mit Zonen der Knorpelverkalkung, Zonen der Chondrozytenhypertrophie,Teilungszonen (S�ulen, Knorpel und Reserveknorpelzonen (hoher Knorpel)) entstehen.

Erfindungsgem�ss f�rdert EPO dieVaskulogenese auch im Bereich des Kno-

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chens, insbesondere die Ausbildung einer Arteria Nutricia, die Metaphysengef�sse und die Epiphysengef�sse. Zus�tzlich werden die Periostgef�sse ortsspezifisch integriert.

EPO f�rdert die Ausbildung des Nukleuspulposus und Anulus pulposus sowie des hyalinen Knorpels im Bereich derZwischenwirbelscheiben. In Gelenkstrukturen werdenAussenligamente,Innenligamente undKapselverst�rkungs- b�nde in der Ausbildung gef�rdert. Reparaturprozesse derSynovialmembran sind hierbei beinhaltet. Erfindungsgem�ss f�rdert EPO nach Entz�ndungsreaktionen die Wiederausbildung der glatten Muskulatur, der gestrafften Muskulatur und des Myokardgewebes.

7. Glatte Muskulatur Die Histogenese der glattenMuskeizellen wird durch EPO in der Ausbildung und Differenzierung zuMyoblasten aus Mesenchymzellen gef�rdert. In derSkelettmuskulatur f�rdert EPO die Ausbildung des Perimysium und des Endomysium. Durch EPO kommt es zu einer Integration und Koordination des Einwachsens motorischer Nervenfasern und der Ausbildung motorischer Endplatten. EPO f�rdert die Histogenese des Herzmuskels. Die Herzmuskulatur besitzt normalerweise keine oder nur sehr geringe Regenerationsf�higkeit. EPO wird erfindungsgem�ss eingesetzt um die Geweberegeneration der glatten Muskel-zellstrukturen, derSkelettmuskulatur und des Herzmuskelgewebes zu erreichen und einimunmodulatorischenAbkling-Effekt durch R�ckkopplung zu erreichen.

Dies ist von Bedeutung f�r die Therapie bei entz�ndlichen autoimmunen Mus-kelerkrankungen.

8.Nervengewebe

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In der dreidimensionalen Geweberegeneration spielt die Verbindung mit Nervensystemen und Innovationsprozessen eine grosse Rolle. Erfindungsgem�ss wird EPO zu einer Koordination der Vaskulogenese mit der Neurogenese und der Zusammenf�hrung dieser Strukturen in der Innovation von parenchymen Dr�sen, Geweben und Organen verwendet. Hierdurch kommt es zur Wiederausbildung von synaptischen Kontakten, der Ausbildung von Neuronen als Lamin� und vertikalen Einheiten und der Ausbildung von Nervenfasern und Fasertrakten. Verbindungsstrukturen im Bereich der Ganglienplexen werden hervorgerufen. Die Hirnnerven undKranialnerven werden einbezogen, die Spinalnerven werden nach Trennungen regeneriert und sowohl efferente motorische als auch afferente oder sensible Strukturen werden wieder neu geschaltet. Unterst�tzend k�nnenNervenleitschienen eingesetzt werden, die aus Biopolymeren, (biodegradable oder nicht-biodegradable (Silikon, Polyurethan)) bestehen k�nnen oder biologischen Ursprungs, oder synthetischen Ursprungs (z. B.

Collagen, Elastin, Fibronektine, Polylaktid, Polyhydroxybutyrate, Seide) sein k�nnen und in Kombination mitStammzellen verwendet werden k�nnen. DieStammzellen k�nnen mesenchymalen Ursprungs sein. Sie k�nnen aber auch aus den Gewebestrukturen der neuronalen Strukturen direkt rekrutiert werden, wobei es sich nicht um eine Apoptosevermeidung handelt, sondern um eine Initiation des Neuritenwachstums und der Vermehrung in eine gerichtete dreidimensionale Struktur.

Ein wichtiger Effekt der EPO-Wirkung ist die Geweberegeneration im Bereich der Bindegewebsstrukturen des zentralen Nervensystems, insbesondere der Meningen und deren begleitenden Blutgef�sse. Diese Wirkung ist sehr wichtig f�r die Regeneration von Ganglien und Sinnesorganen. Erfindungsgem�ss wird die Ausbildung von Axonstrukturen und die Ausbildung von Axonen erm�glicht.

Die elektrophysiologische Aktivit�t und der axonale Transport wird wieder hergestellt, sobald eine Quervernetzung erreicht wird. Durch kombinierte Gabe mit

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Vitaminen, zum Beispiel Vitamin C, k�nnen diese Prozesse unterst�tzt werden.

Wichtig aber ist die erfindungsgem�sse Wirkung in der Gewebsregeneration in dem Zusammenspiel zwischen einer Aktivierung durch ortsst�ndige Plasma- zellen, Makrophagen, Lymphozyten unter Umst�nden Mastzellen, die zu einem zellul�ren Rekruitment und einem reparativen Verhalten f�hren (nach therapeu- tischer EPO-Gabe). Im zentralen Nervensystem kann EPO erfindungsgem�ss auch f�r die Regeneration im Bereich degenerierter Strukturen eingesetzt wer- den. Hierzu z�hlen Morbus Parkinson und Degeneration im Striatumbereich sowie Morbus Alzheimer und die amyotropheLateralsklerose, die auch in die Peripherie ausstrahlt sowie die Multiple Sklerose und bei organisch bedingten Depressionen. Wichtig hierbei ist die Behandlung mit Entz�ndungsreizen, so dass die Aktivierungskaskade, die durch EPO ermittelt wird, initiiert werden kann. Eine stereotaktische Implantation mitmesenchymalen Progenitoren und neuronalen Vorl�uferzellen wie auch die Verwendung ortsst�ndiger Progenito- nen regionaler und peripherer Monozyten kann durch EPO therapeutisch ver- st�rkt und zur Regeneration gef�hrt werden. Das Ziel ist die Ausbildung neuer neuronaler Zellen desZentralnervensystems. Erfindungsgem�ss kommt es da- nach zu einer Funktionsaufnahme der Zellen mit einer Bildung neuroaktiver Peptide und Endorphinen sowie z. B. Serotonin, Dopamin, Noradrenalin, Actyl-cholin. Synaptische Prozesse werden wieder verbunden. InBegleitfunktionen der Regeneration werden auch nicht die neuronalen Zellen des ZNS, wie zum Beispiel dieprotoplasmatischen Astrozyten, der fibrill�re Astrozyt,Oligodendro- zyten,Mikrolia(Glioblasten) und das Ependym miteinbezogen. Das Nervenge- webe wird durch EPO nicht nur in einer neuronalen Regeneration, sondern auch in der begleitendenSt�tzzellstruktur der sogenanntenNeuroglia gebildet.

In der Proportionalit�t �bertreffen die Neurogliazellen die neuronalen Zellen bis zum Faktor 10. Sie bilden das Bindegewebsstrukturger�st des ZNS und f�hren die Blutgef�sse. Dies hat eine wichtige regenerative Komponente f�r den struk- turellen Wiederaufbau. Als Ependym versteht man dieEpithelauskleidung der

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inneren Oberfl�chen der Ventrikel im ZNS.

EPO f�hrt erfindungsgem�ss zu einer Regeneration derAxonenh�llen, einer sogenannten Schwannschenscheide. EPO f�rdert die Ausbildung der Myolinscheide (Markscheide). Im ZNS liefern Oligodendrozyten die Myolinscheiden.

Dies ist therapeutisch besonders wichtig bei Erkrankungen der Markscheidenausbildung. Bei den peripheren Nerven werden die Begleitzellen induziert, Ganglien zu umkleiden. DieSchwannzellen werden durch EPO stimuliert im Bereich des Regenerationsprozesses die neue Ausbildung der peripheren Nerven mit zu erm�glichen. Es kommt hier zur Ausbildung der interperiodischen Linien der Myelinsegmente.

EPO f�rdert erfindungsgem�ss die Ausbildung der grauen und weissen Substanz und deren gewebespezifische Differenzierung im ZNS. EPO unterst�tzt die Ausbildung von Ganglien (Ansammlung von Nervenzellen ausserhalb des ZNS).

Nach traumatischen Situationen kommt es zur Regeneration dieser Strukturen. Die Regenerationsprozesse auch im regenerativen Bereich werden �ber die EPO-Modulation zu einer Neoinnervation gef�hrt, wobei es ausgehend vonTr�nendr�se, Unterkieferdr�se, Unterzungendr�se sowie Ohrspeicheldr�se, Herz,Kehlkopf, Luftr�hre, Bronchien, Lunge, Magen, D�nndarm, Blutgef�sse des Bauchraumes und weitere Blutgef�sse, Leber, Gallenblase, Galleng�nge,Bauchspeicheldr�se, Nebennierenmark, Dickdarm, Mastdarm, Niere, Harnblase und Geschlechtsorgane zu einer Neoinnervation kommt als reparativer Prozess. Im Bereich des sympathischen Grenzstranges und des sympatischen Gangliums (Ramus communicans albus und ramuns communicans griseus und nervussplancnicus, Ganglium coeliacum undganglium mesintericum superius) kommt es zu reparativen Prozessen. Die Nervenendungen k�nnen durch die Regenerationsprozesse auch in die mehrschichtigenPlattenepithelstrukturen integriert werden.

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Histologisch werdenEndkolbenstrukturen, K�rperchen und sogenannte PaciniK�rperchen an den sensiblen Strukturen wiederhergestellt. EPO unterst�tzt die Ausbildung der Dura mater, deren Struktur wiederum Bindegewebsleitstrukturen sensibler Nervenblutgef�sse enth�lt. Dadurch kommt es zur AusbildungSubduralraumes (Ausbildung des duramatisspinalis) und desEpiduralraumes.

Die dura materencephalica haftet am demSch�delknochens an und wird durch die EPO-Stimulation im Rahmen des Regenerationsprozesses wieder aufgebaut. Die Arachnoidia erstreckt sich in denSubarachnoidialraum. EPO-Regenerationsprozesse stimulieren auch die Wiederherstellung desSubarachnoidial- raums und der weichen Hirnhaut. Diese kann Beziehungen zumkardiovaskul�- ren (Virchow-Raum) aufnehmen. EPO f�hrt zu einer Wiederherstellung der d�nnen Bindegewebslage die die Oberfl�che von Gehirn und R�ckenmark bedeckt. Es kommt zur Regeneration der ven�sen Sinus der Arachnoidiazotten.

Insbesondere der plexus chorioidius und dieHirnventrikel werden regeneriert.

Die erfindungsgem�sse Gabe von EPO f�hrt bei Entz�ndungsprozessen zu einerWiederausbildung der Bluthirnschranke durch strukturelle Geweberegeneration. Die funktionelle Bedeutung dieser Regeneration die sich �ber das gesamte Hirngewebe einschliesslich der medullaoblongata mit Ausnahme der Neurohypophyse erstreckt, ist von grosser Bedeutung f�r die Hom�ostase des ZNS. Die Barriere wird mit Astrozyten durch EPO-Gabe wieder erneut ausgebildet.

Histogenese des Nervensystems durchEPO-Einwirkung Nach Trauma im zentralen Nervenbereich und degenerativen Prozesse sind das Zusammenspiel zwischenGliazellen,Oligodendrozyten, Neuronen, Subdu-rafraum und Blutgef�ssen gest�rt. Diese r�umlichen Verbindungen und die darin befindlichen Begleitzellen sind in einer Histogenese physiologisch beteiligt.

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Dennoch kommt es bei Verletzung zu Heilungsproblemen, da die neuronalen adulten Gewebe nicht regenerationsf�hig im gew�nschten Umfang sind. Durch die Gabe von EPO kann erfindungsgem�ss dieser Prozess in eine regenerative Richtung beschleunigt gef�hrt werden und die strukturelle Wiederherstellung durch die Verbindung der strukturellen Anteile mit denParenchymanteilen erreicht werden. In der Embryonalentwicklung l�uft dieser Entwicklungsschritt nach einem festgesetzten Zeitplan ab. EPO ist im ZNS eine vermittelnde Struktur in Verbindung mit z. B. dem Nervenwachstumsfaktor (NGF). Die mangelnde Regenerationsf�higkeit des ZNS im adulten Organismus wird durch EPO-Gabe dadurch kompensiert, dass ein Recruitment der ortsst�ndigenZel- len, immunmodulierende Zellen, Abr�umzellen (Makrophagen) und Stammzellen erfolgen kann.Stammzellen (z. B. autolog aus peripheren Blut CD45 positivenZellen, mesenchymale Stammzellen, aus Fettgewebe, aus Nabelschnurgewebe) und andere Stammzellen k�nnen kombiniert werden. Die Verwendung autologer Gewebe ist der Verwendungallogener Zellen (z. B. embryonaler Zellen) vorzuziehen, von dem EPO Effekt aus immunologischen Gr�nden abzutrennen aber nicht auszuschliessen).

In Kombination mit stereotaktischen Operationen oder Infusionen k�nnen die Progenitoren ortsspezifisch positioniert werden. Durchtrennte oder verletzte periphere Nervenfasern k�nnen durch EPO-Gabe in Verbindung mit Leitstrukturen, Leitschienen oder auch in Verbindung mit biologischen Strukturen vor Ort (aus der unmittelbaren Umgebung) in die gew�nschten Bereich gelenkt werden z. b. auch durch Fibrinstrukturen.Fibroblastenstrukturen k�nnen auch in anderen Bereichen mitStammzellen und EPO integriert werden. Alternativ k�nnen auch biologische Matrixmolek�le auf der Basis von Kollagenen oderElastinen in rekombinanter Form oder bestehend aus Peptidsequenzen, in Gemische eingebracht werden, wodurch es zu Injektionsl�sungen kommt, die durch EPOGabe vermittelt werden k�nnen. Parallel kann die Neuregeneration auch sys-

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temisch unterst�tzt werden durch Gabe von EPO. Ohne die Gabe von EPO und die Stammzellunterst�tzung kommt es zur sogenannten Wallerschen Degeneration, die seit 1850 bekannt ist. Entlang des sogenannten B�ngner Bandes kommt es zuRegenerationsprozessen. Im ZNS kommt es nach 12 bis 24 Stunden nach einer L�sion zu terminalen Degenerationsph�nomenen. DerZelik�r- per l�st sich durchChromatolyse auf. Die regenerativen Prozesse, die durch EPO beschleunigt werden, f�hren zu einem Axonenaufbau. Durch EPO wird dieNesselsubstanz und der Golgi-Apparat erneuert. Die Schwellungen des Zellk�rpers nehmen ab, w�hrend in physiologischer Weise in der ersten Woche nach einer L�sion Regenerationsph�nomene bei peripheren Axonen auftreten.

Durch die erfindungsgem�sse Gabe von EPO kommt es zu Beschleunigungen der Regeneration, sodass unterhalb einer Woche bereits Regenerationsph�nomene, wie die Ausbildung von Philopodien und protoplasmatischen Wachstumskeulen erm�glicht werden. Die axonalen Philopodien ben�tigen normalerweise zwei Wochen, um in den Schwannzellen H�hlen in das distale Segment einzuwachsen. Durch biologische Strukturen und Kollagene k�nnen diese Strukturen beiKomplettdurchtrennung �berbr�ckt werden. Eine Anwendungsform f�r die Nervenschienung stellen z. B. EPO beschichteteKollagenr�hrchen dar. Andere Tr�germaterialien wie Polylaktid bzw.Poldhydroxyalkanoate k�nnen ebenso verwendet werden. Die Kombination mit Stammzellen und autolegem oder allogenem Fibrin als Leitstruktur ist m�glich.

Bei Polymyolitis-Zust�nden wird durch EPO-Gabe eine Neosynthese des Perineuriums erreicht. Dieser f�rdert die Ausbildung vonkollateralen Sprossungen im ZNS.

9. Leber Nach viralen Infektionen der Leber (z. B. Hepatitis A, B, C, D) kann es zu Regenerationsdefekten der Leber kommen. DieLebercirrhose stellt das Endstadium

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eines Regenerationsdefektes der Leber dar, bei der es zu bindegewebigem Ersatz der parenchymat�sen Zellen gekommen ist, da die k�rpereigene Regeneration nicht entsprechend mit der Rate einer durch Noxen bedingten Sch�digung durch kontinuierliche Regeneration mithalten kann.

Nach Trauma und operativen Eingriffen, z. B. bei Tumorresektionen der Leber, kommt es zu einem akuten Verlust viablen Gewebes und zur Gewebezerst�rung.

Erfindungsgem�ss kommt es nach Gabe von EPO zur beschleunigten Regeneration der Hepatozyten undnicht-parenchymalen Zellen der Leber bis zur Restitutio adIntegrum. Charakteristisch hierf�r ist dieWiederausbildung einer normalen Leberl�ppchen Architektur, die Wiederausbildung desinterlobul�ren Bindegewebes, der Zentralvenen und derGlisson-Trias : Dort werden erkennbar dieGalleng�nge, Lymphgef�sse, periportale Bindegewebe, Arterien und Vena interlobularis neben denLeberzellen wiederhergestellt.

Die spezifische Ausbildung der intralobul�ren Retikulinfasergeflechts und der Lebersinusoide wird wieder hergestellt. Der histologische Aufbau nach Regeneration zeigt die typische Balkenstruktur. Die Fensterungen im Bereich der En-dotheizellen weisen auf eine typische Leberauspr�gung hin. Wichtige Initiatorzellen nach Trauma sind dieKupfferzellen dieIL-6,IL-1, TNF-alpha freisetzen.

Die Gabe von EPO f�hrt zu deutlich h�heren Regenerationsprozessen selbst im Vergleich zu Lebergewebe ontogenetisch junger Lebern. In vitro-Faktorerh�hung um Faktor 10 bis 30 werden erreicht.

10.Gallenblase : Bei Entz�ndungen der Gallenblase und auch nach mechanisch bedingten Ver-

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letzungen derGallenblase kommt es bei therapeutischer EPO Gabe zu einer Wiederherstellung des normalen Wandaufbaues wie folgt : Bindegewebe (Kapsel, mitLeberkapsel verwachsen), Tunica muscularis, Luschka G�nge, Lamina propria (reich vaskularisiert) und Tunica mucosa (mit Epithel, einschichtig, hochprismatisch). Lymphgef�sse, Nerven aus dem Bereich des Vagus werden wieder angeschlossen.

11.

Pankreasregeneration : Die EPO Gabe unterst�tzt eine Regeneration der B-Zellen, D-Zellen und AZellen des Pankreas. Die Regeneration beginnt aus den kleinen Epithelstr�ngen, die aus den Ausf�hrungsg�ngen hervorgehen. Die Venen und Arterien des Pankreas werden mitregeneriert.

Die regenerativen Prozesse betreffen den endokrinen und exokrinen Anteil nach Trauma, entz�ndlichen Erkrankungen oder immunologischen Automimmunprozessen.

12. Nasenh�hle undNasennebenh�hlen : Septum nasi,Vestibulum nasi, Nasenh�hle,Nasenmuscheln unterliegen nach Verletzungen und EPO Gabe regenerativen Prozessen. DasEpithel wird wiederhergestellt und ebenso die lamina propria (straffes, kollagenes Bindegewebe mit tubuloalveol�ren mukoser�sen Dr�sen), Gef�sse mit arterioven�sen Anastomosen undSchwellk�rpern, adrenerge und cholinerge Nerven. Im Bereich der Riechschleimhaut wird das sehr hohe Epithel und die ser�sen Bowman-Dr�sen wiederaufgebaut.

13.Kehlkopfbereich (Larvnx) : Das mehrreihige hochprismatischeFlimmerepithel, die lamina propria, die ser�sen Dr�sen und die gemischt-seromuk�sen Dr�sen werden durch EPO/TPO Gabe mit und ohneStammzellkombination wieder hergestellt.

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14. Luftr�hre : Wiederherstellung des typischen Wandaufbaues mit Perichondrium, hyaliner Knorpel, Perichondrium, lamina propria mit seromuk�sen Dr�sen, Submukosa, Lamina propria und Epithel. Die Adventitia wird an der Peripherie regeneriert und die Knorpelspangen durch glatte Muskulatur verbunden. Im Eptihel befinden sich Becherzellen, Basalzellen und Flimmerzellen. Ebenso endokrine (Pa-) Zellen,Typ I und TypII B�rstenzellen.

15. Lungen : Die komplexe 3-D Architektur und Struktur der Lunge wird erfindungsgem�ss wie folgt wiederhergestellt. Arteria bronchialis, Dr�sen, Bronchus, �ste der arteria pulmonallis, Bronchiolen, glatte Muskulatur und �ste der venapulmonalis, ducti alveolar, Alveolens�ckchen und die Pleura-Umkleidung wird dreidimensional zusammengef�hrt. In denbronchopulmon�ren Segementen werden intersegementale Septen, Segementvenen und Segmentarterien regeneriert. In den Bronchien werden Epithel, lamina propria, tunica muscularis, Dr�sen und Knorpel regeneriert. In den Alveolen wird die Blut-Luft Schranken-Funktion wiederhergestellt.Elastinstrukturen werden regeneriert.Alveolarepithelzellen (Typ I und11) treten wieder auf. Blutgef�sse, Lymphgef�sse und Nerven (plexus pulmonalis) werden dreidimensional koordiniert duch EPO und/oder Stammzellintegration eingef�gt.

16.Harnsestem : Die regenerativen Wirkungen im Bereich der Niere blieben bisher unbekannt, da EPO bei chronisch insuffizienten Nieren substitutiv f�r den EPO Mangel eingestetzt wurde. Bei traumatischen Verletzungen, Entz�ndungen und toxischen oder immunologischen Sch�digungen kommt es erfindungsgem�ss durch EPO

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Gabe mit und ohneStammzellen/Progenitoren zur Regeneration der urologischen Systeme. In der Niere kommt es zur Regeneration der Rindenstruktur, derNierenkelche, des Marks, der Markstrahlen, Nierenpyramiden und der Columna renalis.

Es kommt zur Regneration der Mesangialmatrix, derMesangiumzellen, des Glomerulus (mit lamina rara interna, lamina densa, lamina rara externa. Die strukturellen Beziehungen der Kollagenfilamentb�ndel, der Mesangialzellen, Podozyten und Endothelzellen werden wieder hergestellt. In der Nierenrinde werden Sammelrohr, Hauptst�ck, Mittelst�ck, Macula densa, juxtaglomul�re Zellen und Vas afferens regeneriert. Im Mark der Niere kommt es zur Wiederausbildung der charakterisistische interstitiellen Zellen und des ductus papillaris.

Die Harnleinterstruktur wird in die Tunica adventitia, Ringmuskulatur und L�ngsmuskulatur der Tunica muscularis, lamina propria, undEpithel (tunica mucosa) regeneriert. DieHarnblase wird zur Wiederherstellung des Epithels, lamina propria (tunica mucosa), tunica submucosa (L�ngs-und Ringmuskulatur) und �ussere L�ngsmuskulatur gef�hrt.

Die weibliche Harnr�hre wird mittels EPO und/oderStammzellen zur Regeneration der Tunica muscularis, des ven�sen Geflechtes, der Dr�senlakunen, der lamina propra und des �berwiegend unverhornten Plattenenepithels gef�hrt. Bei der m�nnlichen Harnr�hre wird die pars prostatica, der musculus sphincter uretrhae und das diaphragma urogenitale, utriculus prostaticus, pars membranacea, pars spongiosa und die fossanavicularis regeneriert. Auf die Schleimhaut der pars spongiosa folgt das corpus spongiosum. Nach traumatischen Verletzugnen oder operativen Eingriffen kann EPO in Verbindung mit Fibrinkle-

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ber mit und ohneStammzellen in die strukturellen Defekte verbindend injeziert werden oder entsprechend topisch aufgebracht werden.

17. Endokrine Dr�sen : Im Bereich der Hypophyse, Epiphyse, Schilddr�se, Nebenschilddr�se,Bauchschpeicheldr�se(Langerhansinseln), Nebennieren, Ovarien und Hoden kann es durch traumatische Verletzungen, Operationen (z. B. Tumorresektionen) zuGewebeverletzungen kommen. In diesen F�llen kann EPO erfindungsgem�ss in Verbindung mitStammzellen aus dem autologen Knochenmark, Nabelschnurstammzellen, Progenitoren aus dem peripheren Blut (Monozyten) oder durch Recrutiering ortst�ndiger Progenitoren zu einer Geweberegeneration f�hren bzw. diese unterst�tzen. In der Adenohypophyse werden die ba-sophilen Zellen, die arteriaehypophysales superiores und inferiores, die gomitoli sowie die Portalgef�sse wiederhergestellt. Die Neurohypophyse wird in ihrer Zusammensetzung mit Pituizyten, marklosen Nervenfasern aus neurosyekretorsichen Neuronen im Hypothalamus regeneriert. Hierzu werden erfindungsgem�ss EPO-Fibrinstr�nge als Leitstrukturen mit Stammzellen zwischen den Regionen gelegt.Kapselstrukturen werden wie auch in anderen Hirnregionen regeneriert. Bei der Epiphyse wirdHabenula, Recessuspinealis, L�ppchenstrukturen, Hirnsand, Bindegewebssepten und Pia mater (Kapsel) wieder hergestellt. Nervenfasern,Pinealozyten, Astreozyten werden in die spezifischen Strukturen der Epiphyse verbunden.

DieSchilddr�se unterliegt h�ufigen operativen Eingriffen. Die Follikelepithelzellen, C-Zellen, Bindgewebsstrukturen werden entsprechend regeneriert.

Nebennieren bestehen nach der erfindungsgem�ssen Regeneration aus Kapsel, zona glomerulosa, zona fasciculata, zonareticularis. Spongiozyten befinden sich in der zonafasciculata.

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18.Fortpflanzungssvstem : Regenerative Reparaturprozesse k�nnen erfindungsgm�ss durch strukturelle Prozesse bei Ovarien zu einer Wiederherstellung des funktionellen Aufbaues f�hren. Hierzu sind insbesondere die Regenerationsprozesses des Stroma ovarii, der tunica albuginea, diegranulosa Zellen, theca folluculi interna und externa involviert. Die Mesothelauskleidung wird nach Verletzungen wieder geschlossen. In den Eileitern wird der Wandaufbau wiederhergestellt (Epithel, lamina propria (Schleimhaut)), Ringsmuskulatur, L�ngsmuskulatur (Muskelschicht), subser�ses Bindegewebe, Mesothel(Serosa)).

In der Ampulle des Eileiters werdenDr�senzellen, lamina propria und Flimmerzellen regeneriert. Corpus uteri wird in Endometrium, Myometrium und Perimetrium strukturell regeneriert. Schleimhaut (Epithel, lamina propria), Muskelschicht (L�ngsmuskulatur, musculus bulbospongiosus) und Adventitia der Vagina werden regeneriert. Lymphgef�sse und Nervenversorgung werden wiederhergestellt. Neben dem gesamten Gewebebereich der weiblichen Geschlechtsorgane sind ebenso bei den m�nnlichen Geschlechtsorganen Reparaturprozesse nach Trauma und sonstigen Verletzungen m�glich. So werden u. a. Hoden, Nebenhoden, Penis (inkl. corpus cavernosum), Ductus seminiferus, Prostata und deren strukturelle Einbindung in das umgebende Weich-und Hartgewebe koordiniert regenerierbar. Dieblutversorgenden Strukturen, Lymphgef�sse und Nerven werden reintegriert.

19. Milchdr�se : Der strukturierte Aufbau inL�ppchen, Bindegewebe, Milchs�ckchen, Ausf�hrungsg�nge mit dem histologischen Detailaufbau Alveolen, intra-und interlobul�res Bindegewebe,Milchgang, Myoepithelzellen findet durch Regeneration wieder statt. Insbesondere nach Tumorresektionen oder plastischen Eingriffen

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kann das Brustrd�sengewebe in Verbindung mit biologischmodellierbaren scaffolds, EP und Stammzellen neu aufgebaut werden.

20. Zentrales Nervensystem : Im Gehirn und R�ckenmarkbereich spielen insbesondere mechanische und isch�mische Insulte mit nachfolgender Gewebedegeneration bzw. Strukturunterbrechungen eine klinisch bedeutende Rolle. Graue und weisse Substanz, Kleinhirn,Mittelhirn und Grosshirn, Kerngebiete und Faserbahnen werden strukturell zusammenf�hrt und regeneriert.

ZumZwischenhirn z�hlt derEpithalamus, Thalamusdorsalis,Subthalamus und Hypothalamus. Der Bereich des Endhirns umfasst zytoarchitektonsich ca. 50 Felder die strukturell regeneriert werden k�nnen. Die Hauptgebiete sind Fron-tallappen,Temporallappen,Parietallappen undOkzipitallappen. Die Septumregionen, der Bulbus olfactorius sowie die Cortexbereiche k�nnen regeneriert werden. Zu dem Regenerationsbereich derBasalganglien geh�ren das Corpus striatum mit Nucleus caudatus und Putamen, das ventrale Striatum, sowie nucleus accumbens und der nucleus basais. Durch die Regenerationsprozesse k�nnen die Ausf�lle motorischer Areale mit den dazugeh�rigen L�hmungen und die Ausf�lle sensorischer Neurone revidiert werden. Die Sch�digungen im Bereich der motorischen Rinde (z. B. durch Geburtstraumata und Unf�lle) mit den daraus resultierenden spastischen L�hmungen k�nnen revidiert werden. Bei den Sch�digungen der Vorderhorne mit den einhergehnden schlaffen L�hmungen k�nnen ebenso regenerative Prozesse induziert werden. St�rungen der Hippocampusfunktionen rufen schwere St�rungen im Bereich der Orientierungs-undMerkf�higkeit hervor (Korsakoffsyndrom). Bei Sch�digungen kortikaler Neurone kann die damit einhergehende Gefahr der Alzheimerentstehung einged�mmt werden. Bei zerebrovaskul�rer Insuffizienz bis zum Hirninfarkt k�nnen reparative Prozesse durch Regeneration eingeleitet werden.

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21. Auge : Die Regenerationsprozesse erstrecken sich auf die Hornhaut, Bindehaut, Regenbogenhaut, Schlemmkanal,Ziliarmuskel, Linse, Zonulafasern, Ora serrata, musculus rectus medials,Glask�rper, Retina, Gef�sse, dura mater, arachnoidea, Sehnerv, arteria und vena centrais retinae, Netzhaut, Aderhaut und Lederhaut. Der spezifische Aufbau der Cornea mit Kollagenlamelle, Fibroblasten,Elastinfaseren, Kollagenlamelle, Bowmann Membran,Epithelschicht wird wie-derhergestellt. Die Sklera (Lederhaut) wird in lamina fusca, substantia propria und Episklera regeneriert.Linsenepithelien,Augenlider mit epidermalen und dermalen Anteilen, Unterhaut, Schweissdr�sen, Haarfollikeln, Epithel, lamina propria, Tarsus, Melborn-Dr�se, Moll-Dr�se, musculus levator palpebrae, musculus orbicularis oculi wird wiederhergestellt.

22. Ohr :Ohrrnuschel, Mittelohr, Trommelfell, Paukenh�hle, Geh�rkn�chelchen, Musculus stapedius,musculus tensor tympani, antrum mastoideum, cellulae mastoideae und Ohrtrompete, Innenohr und kn�chernes Labyrinth, Cochlea mit den dazugeh�rigen Nerven, Labyrinth und entsprechend das Corti-Organ sind erfindungsgem�ss in die regenerative Prozesse miteinbezogen.

II. Ausf�hrungsbeispiele 1.Zelltransplantation Hepatozyten : Leberzellen werden durch Collagenase-Verdau in �blicher Weise aus nicht tranplantierbaren Organen bzw. Leberresektaten isoliert. (Bader, A., Rinkes,

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I. H. B.,Closs, I. E., Ryan, C. M., Toner, M., Cunningham, J. M., Tompkins, G. R., Yarmush, M. L. (1992) A stable long-term hepatocyte culture system for studies of physiologic processes : Cytokine stimulation of the acute phase response in rat and human hepatocytes.Biotechnol Prog. 8,219-225.) Die isolierten bzw. vorkultivierten Zellen werden in fl�ssigem Stickstoff gelagert.

Nach dem Auftauen der Zellen entsprechend bekannter Protokolle (Karim, N., Allmeling, C., Hengstler, J. -G., Haverich, A., Bader, A. (2000) Diazepam meta-bolism and albumin secretion of porcine hepatocytes in collagen-sandwich after cryopreservation. Biotechnol Letters 22 : 1647-1652) werden die Hepatozyten Suspension/Kulturen mit 100-150IU/kg/KGW Epoetin alfa (bezogen auf den Empf�nger) versetzt. Epoetin alfa wird hierzu in einer sterilen L�sung in einem Volumen von 1-1.5 ml einer 10 ml Hepatozytensuspension mit einer Konzentration von 2-10Millionen/ml Zellen zugegeben.

Diese Suspension wird langsam (1 ml/Minute) intraportal injiziert. Die Suspension kann zus�tzlich mit 1000 IE Heparin versetzt werden, um eine Thrombosierung zu vermeiden.

Alternativ kann das Zell/EPO Gemisch auch unter die Leberkapsel oder direkt in das Leberparenchym an mehreren Stellen injiziert werden. Hierzu empfiehlt es sich die Konzentration der Hepatozyten um den Faktor 2-5 zu erh�hen und das injizierte Volumen entsprechend zu reduzieren.

Die Stichkan�le werden mit handels�blichen Fibrinkleber (Baxter Tissucol) verschlossen. Alternativ kann eine Tamponade mit Kollagenflies verwendet werden. Die Tamponade kann ebenso mit der Epoetin alfa L�sung versetzt werden. Es ist darauf zu achten, dass die Tamponade an derAdh�sionsstelle noch trocken bleibt.

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Der Fibrinkleber stellt ein 2 Komponentenmix dar. �blicherweise besteht eine Komponente aus Fibrinogen und die andere aus einer Aktivierungsl�sung mit Ca++ und Proteinaseinhibitoren (z. B. Aprotinin). In die Aktivierungsl�sung kann Epoetin alfa durch Hinzumischen auf eine Endkonzentration von 100-150IU/kg/KGW gegeben werden.

In analoger Weise k�nnen Stammzellen aus dem Knochenmark, dem Fettge- webe, einem spezifischen Parenchym oder dem Blut (Aufreinigung aus Buffy Coats, CD 34 positive Zellen) ausNabelschnurblut und denmesenchymalen Zellen aus demNableschnurgewebe verwendet werden.

Parallel zur Zelltransplantation in isch�misch, toxisch, infekti�s oder mecha- nisch (traumatisch) gesch�digte Bereiche k�nnen die Zellen in einen Fibrinkle- ber oder autologes Plasma eingebracht und unter Zusatz von Epoetinalfa (100- 150 IU/kg/KGW) zur Polymerisation gebracht werden.

Parallel dazu kann eine EPO-Gabe von jeweils 10000 IE s. c. begonnen wer- den, so dass insgesamt 40000 IE innerhalb einer Woche appliziert werden.

Das Ergebnis ist eine um den Faktor 2-3 erh�hte Geweberegeneration, die zu einer strukturellen Reparatur f�hrt.

2. Postoperative Gabe Nach ausgedehnten Operationen im Herz-Thorax-Gef�ssbereich, der Visceral- chirurgie, der Plastischen Chirurgie aber auch nach ausgedehntem Trauma entstehen Defektsituationen, die zu einer vitalen Gef�hrdung des Patienten f�h-

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ren k�nnen.

Epoetin alfa wird hier in einer Konzentration von 100-150IU/kg/KGW gegeben.

Durch die EPO Gabe kommt es zu einer endogenen Erh�hung des Wachstumshormons um den Faktor 2, wodurch die Geweberegeneration nach der Operation beschleunigt wird. Die restitutio ad integrum tritt um ca. 1-2 Wochen fr�her als bei vergleichsweise ohne EPO Gabe behandelten Patienten ein.

EPO kann auch nach einer split liver Transplantation bzw. Lebertranplantation zur Induzierung der Leberregeneration gegeben werden.

Nach einer Lebertransplantation kommt es vor, dass das transplantierte Gewebe-oder bei Lebendspendern-das verbleibende Gewebe nicht rasch genug und in ausreichender Masse als aktives Gewebe zur Verf�gung steht. In diesem Fall kann bereits 24 h vor der Operation und zum Zeitpunkt der Operation und danach in 24 h Abst�nden 100-150IU/kg/KGW Epoetin alfa gegeben werden. Hierdurch kommt es zu einer deutlich beschleunigten Leberregeneration wobei postoperativ insbesondere am 4-5 Tage eine Volumenzunahme im Ultraschall diagnostizierbar ist.

3. Gabe nach operativer Leberresektion bei gut-und b�sartigen Tumoren Bei einer ausgedehnten Leberresektion besteht der Bedarf, eine beschleunigte Regeneration zu erreichen, da die Verf�gbarkeit einer ausreichenden Zellmasse wichtig f�r das �berleben der Patienten ist. Nach operativer Resektion kann bei systemischer Gabe 100-150lU/kg/KGW Epoetin alfa oder einer entsprechenden Menge bei topischer Applikation (in Fibrinkleber, Plasma) gege-

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ben werden.

Bei Verdacht auf persistierenden Tumorbefall bzw. nicht ressezierbaren Tumormetastasten k�nnen sowohl systemisch als auch topisch entsprechend dem Tumortyp und der Prognose �bliche Cytostatika in Kombination mit EPO verabreicht werden.

Nach Resektion und Gabe von EPO kommt es zu einem beschleunigten Gr�ssenwachstum der behandelten Gruppe um 30% im Verh�ltnis zu einer nichtbehandelte Gruppe. Vor allem die Hepatozyten an den Resektionsfl�chen treten verst�rkt in den strukturellen Wachstumsprozess ein. Es kommt zu einer vollst�ndigen Ausbildung des Gef�ssbaumes und des darum befindlichen Gewebes. Hierbei sind die Hepatozyten in typischer dem normalen Organ entsprechender Weise in Lobuli mitGef�ssversorgung, Zellplatten mit nichtparenchymalen Zellen (Kupffer, Pit, Ito-undEndotheizellen) angeordnet.

Es kommt zu einem systemischen Gr�ssenwachstum. Das Gr�ssenwachstum endet bei Erreichen der initialen Gr�sse.

Die Gruppe mit perioperativer EPO-Gabe weist bereits am 1-2 Tag postoperativ einen um etwa 0.5g/dl h�heren Hb-Wert auf. Dies ist als Zeichen der bekannten Wirkung des EPO zu werten. Parallel kommt es jedoch zur Leberregneration. Hier vermehren sich nicht nur die Hepatozyten sondern alle Zelltypen und vor allem auch die Bindegewebsstrukturen, die das Architekturger�st der Leber darstellen.

Versuchsdurchf�hrung :

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28 weibliche Schweine (Gewicht 40,0-62, 0 kg) wurden nach demZufaltsprin- zip in drei Gruppen aufgeteilt. DieTeilentfernung der linksseitigen Leber wurde mit der Technik der Bauchendoskopie durchgef�hrt.

Der Kontgruppe (n=16) wurde kein EPO gegeben. Der Gruppe 2 (n=6) wurde eine Kombination aus 10.000 Einheiten EPO und einem Fibrin-Dichtungsmittel(Quixil) lokal auf dieLeberresektionsoberfl�che gegeben. Gruppe 3 wurdeglei- chermassen behandelt ; die Schweine erhielten jedoch zus�tzlich zur lokalen EPO Behandlung 10.000 Einheiten EPO systemisch am Tag 0,3, 7 und 11.

Leberproben wurden von dem herausgeschnittenen Leberst�ck am Tag 0,24 Stunden nach Resektion aus einem Bereich 1 cm unterhalb der Resektionsoberfl�che und 14 Tage nach Resektion unterhalb derResektionsoberfl�che und des rechten seitlichen Lappens entnommen.

F�r den Nachweis von Ki-67 Antigen, PCNA (proliferating cell nuclear antigen = PZNA ProliferationZellkern Antigen) und Apoptose, wurde der Streptavidin-Biotinlmmunperoxidase Assay an mit Formalin fixierten und in Paraffinwachs eingebetteten Lebergewebe durchgef�hrt.

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Ergebnisse

EMI56.1

Gruppe

1

Gruppe

2

Gruppe

3

(Kontrolle

n=16)

(Wachstumsfaktor

(Wachstumsfaktor

lokal

lokal)

und

systemisch)

Lebervolumen

(ml)

892,071

~

130,56

894,02

~

104,705

1073,10

~

190,13*

Lebergewicht

(g)

1001,55

~

155,76

1027,18

~

166,95

1249,42

~

222,51*

Hb(mmol/l)

6,0077

~

0,65

6,550

~

0,89

6,58

~

0,5541

(14. <SEP> Tag)

<tb> Gewicht <SEP> des <SEP> 48,37 <SEP> ~ <SEP> 5,25 <SEP> 52,67 <SEP> ~ <SEP> 6,76 <SEP> 50,54 <SEP> ~ <SEP> 9,801

<tb> Schweins <SEP> (kg)

<tb> Gruppe <SEP> 1 <SEP> Gruppe <SEP> 2 <SEP> Gruppe <SEP> 3 <SEP> WachstumsfakKontrollgruppe <SEP> Wachstumsfaktor <SEP> lo- <SEP> tor <SEP> lokal <SEP> und <SEP> systemisch

<tb> KAL

<tb> Ki <SEP> 67 <SEP> 14. <SEP> Tag <SEP> 1,85 <SEP> ~ <SEP> 2,01 <SEP> 14,0 <SEP> ~ <SEP> 12,11* <SEP> 15,08 <SEP> ~ <SEP> 15,71*

<tb> (%)

<tb> PZNA <SEP> 25,33 <SEP> ~ <SEP> 9,82 <SEP> 29,87 <SEP> ~ <SEP> 7,18 <SEP> 37,16 <SEP> ~ <SEP> 14,32

<tb> (%)

<tb> Apoptose <SEP> 0,56 <SEP> ~ <SEP> 0,429 <SEP> 0,267 <SEP> ~ <SEP> 0,103 <SEP> 0,56 <SEP> ~ <SEP> 0,30

<tb> (%)

<tb>

Arithmetisches Mittel und Standardabweichung *p#0,05

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4. Optimierte Endoprothese bzw. Implantate Implantate k�nnen aus biologisch abbaubaren aber auch aus permanenten Materialien bestehen. Ein Beispiel hierf�r sind metallische Endoprothesen z. B. im H�ftbereich. Im Anschluss an die Herstellung der metallischen Rohform wird eine Mikrostrukturieurng durch Abrasion, �tzen oder Laserbehandlung erreicht.

Hierdurch k�nnen offene Porosit�ten und Rauhigkeiten im Bereich von.1 bis 50-60 um erzeugt werden.

Diese Strukturen werden anschliessend in einer L�sung aus phasenreinem beta Tricalziumphosphat aufgef�llt, so dass eine homogene Oberfl�chenbeschichtung erreicht wird. Danach werden die Strukturen idealerweise einem weitergehendem Sinterungsprozess unterzogen, um die beta-TCP Strukturen zu festigen.

In den mineralischen Strukturen k�nnen l�sliche Salze/Zucker eingebaut werden, bzw. Gasbildungen induziert werden um weitere interkonnektierende Porosit�ten zu erreichen. Im Anschluss an diesen Fertigungsprozess werden die Strukturen mit dem erfindungsgem�ssen Wachstumsfaktor oder dessen Derivaten, Teilen oder Analoga impr�gniert bzw. beschichtet. Depots k�nnen entsprechend an den Oberfl�chen gesetzt werden, indem die Kavit�ten sich mit EPO f�llen bzw. slow release Substanzen verwendet werden. Alternativ kann auch unmittelbar vor der Implantation das steril aus der Verpackung entnommen Implantat mit EPO und deren Analoga beschichtet werden.

Es kommt dadurch zu einem verbesserten Gewebeverbindungsprozess mit dem Implantat. Der Knochen wirdmakrovaskul�r verbunden und dass Implantat beschleunigt und nachhaltiger oss�r integriert.

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In �hnlicher Form k�nnen Implantate im Mund-, Kiefer-und Gesichtsbereich vorbereitet werden (Zahnimplantate).

Eine Verbindung mit einer zellul�ren Besiedlung in Bioreaktoren mit Stammzellen ist m�glich.

Biologische Implantate (Gef�sse, Herzklappen, Haut) und Membranen k�nnen ebenso mit EPO und oder GH und oder TPO beschichtet werden.

5. Behandlung der Osteoporose EPO beschichtete Tricalziumphosphat Granula werden mittels einer Nadelpunktion in defizit�re/rarefizierte Wirbelk�rper in einerautologen Plasmal�sung eingebracht. Dort werden die Granula beschleunigt in endogenen Knochen umgebaut und der Degenerationsprozess in einen anabolen Effekt umgewandelt.

Der Effekt kann bei akut einbruchgef�hrdeten Wirbelk�rper verwendet werden.

Eine Kombination mit einem Besiedlungsprozess vorteilhafterweise mit Stammzellen aus dem autologen Knochenmark bzw. dem Periost und Blut und/oder Fettgewebe.

6. IndikationKnoroetregeneration Knorpelzellen stellen stark bradytrophe Gewebe dar. Durch ein regionales Trauma und Abrasion entstehen Entz�ndungsprozesse, die in eine Arthitis m�nden k�nnen. Durch Gabe von EPO in den Gelenkspalt bzw. systemisch und/oder in Kombination mit zellul�ren Transplantaten von Chondrozyten bzw. osteochonralen Zylindern wird die Geweberegeneration und der strukturelle

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Neuaufbau gef�rdert Die kombinierte systemische bzw. subkkutane Gabe von 10000 IE/Tag ist m�glich.

*7. Indikation Hauterkrankungen Schlecht heilende Wunden werden nach Vorbereitung des Wundbettes erfindungsgem�ss mit EPO oder TPO (Derivate, Analoga, Teile) beschichtet. Hierzu wird bevorzugt ein mechanisches Debridement durchgef�hrt. In die Blutkoagel werden 10 000 IE EPO eingebracht. Diese Prozess kann bis zur Reinigung des Wundgrundes wiederholt werden.

Das strukturelle Wachstum beginnt nach 2-3 Tagen f�hrt zur beschleunigten Ausbildung eines Granulaitionsgewebes.

8. Indikation entz�ndliche Darmerkrankungen Bei Entz�ndungsph�nomenen des Darmtraktes mit Gewichtsverlust und An�mie hat sich herausgestellt dass die An�mie nicht ein Sekund�rph�nomen auf Grund der schlechten Nahrungsresorption ist, sondern Begleiterscheinung eines origin�ren EPO Mangels sein kann. Die Gabe von EPO in 10 000 IE/Tag f�hrt zu einer Verbesserung der Darmwiederherstellung/Regeneration.

9. IndikationNeuroreaeneration Nach Druchtrennungen des R�ckenmarks f�hrt EPO zu einem strukturellem Wachstum der Neurone und Neuaussprossung der Axone. Unterst�tzend wirkt die Gabe von Vitamin C.

EPO kann regional in Verbindung mit Fibrinkleber/autologem Plasma und/

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oder k�rpereigenen Stammzellen (Knochenmark, Blut CD 34, aus Fettzellen, Periost, Nabelschnur) gegeben werden.

10. IndikationParkinson/Beispiel einer chronischen Erkrankung mit bereits abgeklungener Entz�ndungsreaktion Autologe Makrophagen, die durch Stimulation mit degradablen Partikeln stimuliert wurden, werden stereotaktisch in degenerierteAreale integriert. Parallel hierzu wird EPO (10 000 IE) in Verbindung mitautologen Stammzellen (0.3 ml) in dasAreal injeziert. Parallel hierzu wird EPO �ber 2 Wochen stemisch verabreicht. Dieses Stimulationsprinzip der Induzierung einer Entz�ndung durch Makrophagen kann auch bei anderen chronischen Erkrankungen eingesetzt werden, bei denen kein akutes Trauma oder eine akute Entz�ndungsreaktion vorherrscht.

11. Wundheilung nachBrandverletzung Bei 8 brandverletzten Patienten heilten bei EPO Gabe dieDonorstelle des Hauttransplantates um 50% schneller ab. Tief zweitgradige (Grad 2B) Verbrennungswunden im Gesicht heilten ohne Narbenbildung ab, wenn EPO den Patienten gegeben wurde. Ohne EPO Gabe heilten derartige Wunden mit Narbenbildung ab.